刘双凤，颜灿群，占克斌

骨髓间充质干细胞移植对脑缺血大鼠神经功能及IL-10、TNF-α水平的影响

刘双凤a，颜灿群b，占克斌a

目的：探讨骨髓间充质干细胞（MSC）移植治疗对大鼠脑缺血后神经功能及脑组织中IL-10、TNF-α表达的影响。方法：原代分离培养MSC。27只大鼠随机分为3组，各9只：假手术组，仅剪开皮肤；模型组，制作局灶性大脑中动脉闭塞（MCAO）模型，术后24 h尾静脉注射PBS；MSC组，制作MCAO模型，术后24 h尾静脉注射移植MSC。术后第3天行改良大鼠神经功能缺损评分（mNSS）评定大鼠神经功能；行为学测试后取梗死灶周围缺血半暗带脑组织，western blot法检测肿瘤坏死因子（TNF）-α、白细胞介素（IL）-10蛋白表达水平。结果：与模型组比较，MSC组mNSS评分升高（P＜0.05），脑组织蛋白IL-10表达水平上调（P＜0.05），TNF-α表达水平下调（P＜0.05）。结论：尾静脉移植MSC治疗可改善局灶性脑缺血大鼠神经功能，可能与移植MSC后脑组织中TNF-α和IL-10水平有关。

骨髓间充质干细胞；大脑中动脉闭塞；白细胞介素-10；肿瘤坏死因子-α

骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cell，MSC）具有高度增殖及多向分化潜能，可分化为神经元样细胞和神经胶质细胞[1,2]。动物实验发现，缺血再灌注损伤后MSC可存活并迁移到大脑内，MSC移植治疗后大鼠的神经功能显著好转[3]。本实验旨在探寻MSC治疗缺血性脑损伤的神经修复的可能机制。脑缺血诱导激活炎症细胞释放细胞因子、趋化因子、粘附分子和蛋白水解酶等炎症细胞因子，加重组织损伤[4]。肿瘤坏死因子（tumornecrosisfactor，TNF）-α、白细胞介素（interleukin，IL）-10、IL-8等细胞因子通过募集炎性分子启动和加速炎症反应进程。细胞间黏附分子、血管细胞粘附分子-1和选择素等炎性因子可以吸引更多的白细胞渗入缺血区域，导致神经元细胞进一步损伤[5]。IL-10等抗炎因子可抑制脑缺血后促炎因子的产生。MSC可通过自分泌、旁分泌及近分泌等方式分泌大量生长因子及细胞因子，影响细胞生长微环境从而影响细胞增殖和分化。因此我们假设MSC通过上调抗炎因子和下调促炎因子来保护缺血损伤过程中的脑细胞。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物新生SD大鼠，体质量70～80 g，用于分离培养MSC；成年雄性SD大鼠27只，体质量250～280 g，用于制作脑缺血模型；所有实验动物均由南华大学实验动物中心提供，实验对动物的处理方法符合中华人民共和国科学技术部颁发的《关于善待实验动物的指导性意见》。

1.1.2 主要试剂胎牛血清购于杭州四季青公司，DMEM/F12购于Hyclone公司，台盼蓝购于碧云天公司，MTT检测试剂盒购于武汉谷歌科技有限公司，IL-10、TNF-α一抗购自美国abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 MSC原代分离培养及纯化全骨髓贴壁培养法培养MSC[6]。脊椎脱臼法处死大鼠，酒精浸泡消毒30 min后移至超净台，取双侧后肢腿骨，剪掉干骺端，收集骨髓。将骨髓细胞用添加有青霉素及链霉素含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基吹打至细胞悬液，接种于T-25细胞培养瓶中，置5%CO2、饱和湿度、37℃培养箱中培养，3～5 d后全量换液。待贴壁细胞生长至汇合度达80%时，1:3传代[7]。取第3代细胞进行后续实验。MSC细胞鉴定参考本实验室所发表文章[8]。

1.2.2 检测移植细胞活力台盼蓝拒染试验检测移植细胞的活力比率。收集培养瓶中培养液，0.25%胰酶将贴壁生长的MSC消化，离心，将获得的细胞用磷酸盐缓冲液重悬后加适量染液，在显微镜下计数蓝染及非蓝染细胞，计数存活细胞比率[9]。

1.2.3 动物模型及分组Longa线栓法制造大脑中动脉缺血（middle cerebral artery occlusion，MCAO）模型。术后24 h参考Bederson JB评分法行神经功能缺损评分，评分为2～4分视为模型制作成功。大鼠随机分为3组，各组9只：假手术组，仅剪开皮肤；模型组，制作MCAO模型，术后尾静脉注射PBS；MSC组，制作MCAO模型，术后尾静脉注射移植MSC。1.2.4 MSC移植治疗[10]用加有青霉素和链霉素双抗的PBS重悬MSC细胞，并调整细胞浓度为3×106/mL。MSC组大鼠于MCAO术后24 h尾静脉注射移植MSC 0.5 mL；模型组通过尾静脉注射等量的PBS。

1.2.5 行为学测试移植后第3天进行行为学测试。采用单盲法，使用改良大鼠神经功能缺损评分（mNSS）评定大鼠的神经功能。mNSS包括运动试验、感觉试验、反射丧失及不正常运动和癫痫、肌阵挛及肌张力障碍。

1.2.6 检测IL-10、TNF-α蛋白水平行为学测试后处死大鼠，取梗死灶周围缺血半暗带脑组织，常规提取蛋白，western blot法测定标本中的IL-10、TNF-α蛋白水平。

2 结果

2.1 MSC培养

培养14 d得到第3代细胞，细胞迅速扩增，排列紧密，呈长梭形，局部表现为漩涡式生长，生长状态良好，见图1。

2.2 移植细胞活力

台盼蓝染色显示，细胞活性比率为（98.85±0.03）%，见图2。

2.3 神经功能评分

模型组及MSC组大鼠的mNSS评分分别为（6.25±0.245）分及（7.46± 0.318）分，MSC组评分高于模型组（P＜0.05）。

2.4 各组TNF-α、IL-10蛋白表达

Western blot结果显示，模型组TNF-α蛋白表达高于假手术组（P＜0.05），MSC组TNF-α蛋白表达低于模型组（P＜0.05）；MSC组IL-10表达高于模型组及假手术组（P＜0.05）；见图3。

3 讨论

本研究结果显示，脑缺血大鼠给予MSC移植治疗后，损伤的神经功能获得一定的恢复，提示MSC移植治疗有助于改善脑缺血大鼠的神经功能。

图1 第3代MSC镜下形态

图2 台盼蓝染色检测细胞活力

图3 各组大鼠脑组织TNF-α、IL-10蛋白表达

炎症反应在脑梗死发病后神经细胞损伤中具有促进缺血组织修复、再生的保护作用，及加重缺血组织损伤的双重作用。Battiwalla等[11]对大鼠心肌梗死的研究中发现，MSC具有下调梗死大鼠心肌促炎细胞因子TNF-α和上调抗炎细胞因子IL-10的表达；缺血后第3天，大鼠的TNF-α和IL-10水平达到最高峰，因此本研究选用MSC移植治疗后第3天时间点检测相应指标。

TNF-α是与脑梗死有密切联系的促炎因子，具有多种生物学效应[12]。TNF-α在脑梗死的炎症反应中具有破坏血管内皮的完整性、增加血管壁的通透性、降低循环阻力，诱导产生炎症损伤的级联放大效应、瀑布式释放IL-6、IL-8等炎性损伤因子、加重梗死后脑组织损伤的作用。Nayak等[13]研究发现，脑梗死患者TNF-α水平升高者，磁共振弥散加权成像显示，梗死后72 h梗死面积最大。本研究发现，MSC组移植后3 d，TNF-α表达较模型组明显下降，说明MSC移植的神经保护作用可能与改变TNF-α的表达量有关。

IL-10是具有抑制炎症反应的抗炎因子，通过抑制促炎因子的产生、减少趋化因子的生成、中断炎症级联反应，从而减轻炎症反应的组织损伤。Grilli等[14]的研究显示IL-10基因敲除小鼠脑梗死面积较正常野生型小鼠大30%，可能是因为IL-10基因敲除动物脑皮质神经细胞较野生型动物脑皮质细胞对兴奋性神经递质毒性敏感性高及对缺氧耐受性差，说明IL-10对缺血性脑疾病具有保护作用。IL-10是参与急性脑梗死缺血性损伤以及修复过程的重要抗炎因子，具有营养神经和保护神经的重要作用[15]。本研究发现MSC移植后第3天治疗组IL-10较模型组明显上升，说明MSC移植的神经保护作用可能与促进IL-10的释放有关。

综上所述，尾静脉移植MSC治疗可改善局灶性脑缺血大鼠神经功能，可能与移植MSC后脑组织中TNF-α和IL-10的水平有关。但移植后的MSC抑制TNF-α表达、促进IL-10表达的具体机制尚不明确，后续将行进一步实验探索。

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（本文编辑：唐颖馨）

Effects of Transplantation of Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells on the Neurological Function and the Expression of TNF-α and IL-10 of Rats after Cerebral Ischemia

LIU Shuang-feng,YAN Chan-qun,ZHAN Ke-bin.Department of Neurology,The Second Affiliated Hospital of University of South China,Hunan 421001,China

Objective:To investigate the effects of transplantation of bone marrow mesenchymal stem cells (MSCs)on the neurological function and the expression of tumor necrosis factor-alpha(TNF-α)and interleukin-10 (IL-10)in rats after cerebral ischemia.Methods:Twenty-seven SD rats were randomly divided into 3 groups,sham group,ischemia group and MSC group(n=9 respectively).The middle cerebral artery occlusion(MCAO)model was induced with filament occlusion method.Rats in the ischemia group were transplanted with primarily cultured MSCs 24 h after MCAO.Neural function was evaluated and the expression of TNF-α and IL-10 were assayed at day 3 after operation.Results:When compared with those in the ischemia group,the neural function was significantly improved(P＜0.05),the level of TNF-α protein was significantly decreased(P＜0.05)and the level of IL-10 protein was significantly increased(P＜0.05)of those in MSC group.Conclusion:Transplantation of MSCs could promote the nerve function recovery after cerebral ischemia.

bone marrow mesenchymal stem cells;middle cerebral artery occlusion;interleukin-10;tumor necrosis factor-alpha

R741；R741.02

ADOI10.3870/sjsscj.2015.02.004

1.南华大学附属第二医院a.神经内科，b.老干门诊
湖南衡阳421001

湖南省教育厅科学研究一般项目

（No.13C828）

衡阳市科技局基础研究计划项目

（No.2013KJ60）

2015-01-27

占克斌

zhankebin@126.com