赖满香，杨　丽，张荣华△(广东食品药品职业学院，广东广州5050;暨南大学药学院，广东广州5063)

梓醇对OB-OC共育体系中OB、OC活性及OB ERα、β mRNA表达的影响*

赖满香1，2，杨丽2，张荣华2△
(1广东食品药品职业学院，广东广州510520;2暨南大学药学院，广东广州510632)

［摘要］目的:观察中药单体梓醇在成骨-破骨共育体系中对成骨细胞( OB)增殖、OB碱性磷酸酶( ALP)活性、破骨细胞( OC)活性及OB雌激素受体( ER)α及β mRNA表达的影响，从细胞水平阐释其防治骨质疏松症的作用机制。方法:分别选取1 d和5 d SD大鼠分离培养OB和OC，并建立OB-OC共育体系;在共育体系中，用MTT法检测低浓度( 0. 05、0. 1、0. 5、1 mg/L)、中浓度( 2、5、10 mg/L)和高浓度( 20、50和100 mg/L)梓醇干预下的OB增殖率，并以梓醇最佳促OB增殖浓度进行后续实验，实验分为对照组和梓醇组。pNPP法检测各组OB的ALP活性;光镜观察OC骨吸收陷窝数目;重氮盐法检测OC抗酒石酸酸性磷酸酶( TRAP)的活性; RT-PCR方法检测OB ERα 及ERβ mRNA的表达。结果:在OB-OC共育体系中，0. 05～2 mg/L梓醇各组中OB的增殖率显著高于对照组( P＜0. 01)，且0. 05 mg/L梓醇组促进OB增殖的能力明显高于其它浓度组( P＜0. 01)，5～100 mg/L梓醇各组OB的增殖率与对照组比较无显著差异( P＞0. 05)。0. 05 mg/L梓醇组的ALP水平高于对照组( P＜0. 05)，并在作用48、72和96 h后均对OC骨吸收陷窝数及TRAP有明显抑制作用( P＜0. 01) ; 0. 05 mg/L梓醇组OB中ERα mRNA的表达与对照组相比差异无统计学意义( P＞0. 05)，而ERβ mRNA的表达显著高于对照组( P＜0. 05)。结论:梓醇在共育体系中可提高OB增殖和成骨活性，抑制OC活性并上调OB中ERβ mRNA的表达。

［关键词］梓醇;成骨细胞;破骨细胞;雌激素受体

梓醇属环烯醚萜苷类化合物，是地黄的主要有效成分之一［1］。以往药理研究表明，梓醇能重现地黄抗肿瘤、抗衰老、降血糖等作用［2］。最近有文献报道［3-4］，梓醇能促进小鼠MC3T3-E1成骨细胞增殖和分化，不同浓度梓醇能促进SD大鼠骨髓间充质干细胞增殖及骨向分化，这与地黄的提取物具有促进成骨细胞( osteoblasts，OB)增殖分化，抑制破骨细胞( osteoclasts，OC)抗酒石酸酸性磷酸酶( tartrate-resistant acid phosphatase，TRAP)活性，降低OC骨吸收陷窝数量，对骨质疏松症( osteoporosis，OP)有一定的防治作用相一致［5］。考虑到OP的发病机制主要是由于OC介导的骨吸收和OB介导的骨形成之间的平衡失调所致，因此，本实验在体外建立OB与OC共育体系，观察中药单体梓醇在共育体系中对OB增殖、OB碱性磷酸酶( alkaline phosphatase，ALP)活性、OC活性及OB雌激素受体( estrogen receptor，ER)α 及β mRNA表达的影响，为梓醇防治OP的机制研究提供实验依据。

材料和方法

1材料

1.1动物普通级1日龄和5日龄SD新生大鼠，由南方医科大学实验动物中心提供，合格证号为2006B008。

1.2药物梓醇标准品购买于广东省药品检验所。1.3主要试剂低糖DMEM培养基( Gibco)，小牛血清( PAA)，0. 25%胰蛋白酶( Amersco)，Ⅱ型胶原酶( Sigma)，RT-PCR检测试剂盒( TaKaRa)，TRIzol ( Investrigen)，DNA Marker( MBI)。

1.4主要仪器超净工作台(苏州净化设备厂产品)，倒置相差显微镜( Nikon)，CO2培养箱( Thermo)，离心机( Sigma)，细胞培养板( Costar)，酶标仪( Bio-Rad)，紫外分光光度计(北京普析通用仪器有限公司)，PE9600基因扩增仪( PE)，DY-W2型电泳仪(北京生化仪器厂) ; TIGER Gel凝胶分析仪( PE)。

2方法

2.1分离培养OB采用二次酶消化法。取1日龄新生SD大鼠6～10只消毒，取出头盖骨，放入盛有D-Hanks缓冲液的培养皿中，剔除附着的结缔组织及骨膜，D-Hanks冲洗3次，至颅骨呈白色。在0. 25%胰蛋白酶消化液内将颅盖骨剪碎，在37℃条件下恒温消化20 min，以清除纤维组织，弃去消化液。再用0. 1%Ⅱ型胶原酶37℃下消化60 min，不时振荡，收集上清，1 000 r/min离心10 min，去上清，白色沉淀物即为OB。加入培养液制成细胞悬液，调节细胞密度至1×109/L，将其接种于培养瓶中，放入5% CO2、

37℃培养箱中培养10 min后，将培养瓶轻轻倾斜，用吸管吸出培养液至第2瓶培养瓶中，培养10min后，再同样接种到第3瓶培养瓶中，可得到纯度较高的OB。第2天换液，除去未贴壁的细胞。以后每2～3 d换1次液。

2.2分离培养OC采用机械分离法。取5日龄SD大鼠，75%乙醇中浸泡10 min。取出置培养皿中，分离四肢长骨，置于冷D-Hanks缓冲液中。将分离出来的四肢长骨尽量清除骨周软组织后，立即置于冷DMEM分离液内并用解剖刀将骨质轻轻快速刮碎，用圆头滴管反复吹打2 min，使贴附在骨基质上的OC脱落下来，直至骨内表面变白为止，静置1 min。悬液用DMEM培养液稀释到所需密度( 4× 109/L)，按要求接种到有盖玻片或骨片的培养板孔内。置5% CO2培养箱培养30 min，吸去培养液，再用预温的培养液冲掉未贴壁细胞，更换培养液继续培养以备活体观察、细胞染色或用于共育。

2.2.1 两组治疗RAU总有效率的比较 共纳入12篇文献，合计有效率治疗组为89.89%（880／979），对照组为 75.13%（580／772），I2＝52%，采用随机效应模型机型分析，有效率的 RR合并值为1.21，95%CI：1.14～1.29，两组之间治 RAU总有效率的总效应Z＝6.62，P＜0.001，两组间差异有统计学意义。见图1。

2.3OB-OC共育体系的建立对12孔细胞培养板进行改装，在距培养孔底部2 mm的地方打孔，使相邻的4孔间相通，中间加1层0. 45 μm的微孔滤膜，膜与培养板接触处用质量分数3%的琼脂糖凝胶密封。将制备好的培养板置于紫外线灯下照射消毒，备用。以每孔5×104的密度将OB接种到OB培养室内，以每孔5×104的密度将OC接种到OC培养室内，每20 min观察1次OC贴壁情况，同时观察是否有细胞透过微孔滤膜进入OC培养室。

2.4MTT法测定OB增殖率取培养好的第3代OB以每孔3×104的密度接种于OB培养室，3 h后，将新分离的OC以每孔3×104接种于OC培养室; 24 h后换入无血清培养液，待细胞周期同步化24 h后，更换为不同浓度的梓醇培养液。各剂量组的终浓度分别为低浓度组( 0. 05、0. 1、0. 5和1 mg/L)、中浓度组( 2、5和10 mg/L)和高浓度组( 20、50和100 mg/ L)。每个浓度设6个复孔。仅加DMEM完全培养液为空白对照组。分别培养7 d，弃去培养液，DHanks液冲洗3次，更换无血清的DMEM培养基400 μL，同时每孔加入5 g/L的MTT 80 μL，置37℃、5% CO2培养箱中孵育4 h后，在酶标仪上测吸光度( A)，波长为570 nm。参比波长为630 nm。通过实验结果确定梓醇的敏感药物浓度。

2.5实验分组及处理取第3代OB以每孔5×104的密度接种于OB培养室，3h后，将新分离的OC以每孔5×104接种于OC培养室;待细胞周期同步化24 h后，将实验分为对照组和梓醇组，其中对照组仅加DMEM完全培养液，梓醇组加入敏感药物浓度梓醇。

2.6pNPP法检测OB ALP活性各组加入相应药物7 d后，弃去培养液，D-Hanks液冲洗3次，每孔加入500 μL 0. 1% Triton X-100作用30 min，收集细胞裂解液，采用ALP试剂盒检测其活性。用金氏单位( 100 mL血清在37℃与基质作用15 min产生1 mg酚为1个金氏单位)表示，具体操作按试剂盒说明。2.7光镜观察OC骨吸收陷窝数取第3代OB以每孔5×104的密度接种于OB培养室，3 h后，将新分离的OC以每孔5×104接种于OC培养室;待细胞周期同步化后，在已放入象牙薄片的OC室再分别加入敏感药物浓度0. 05 mg/L的梓醇组及对照组，2～3 d换液1次。分别培养24、48和72 h，取出所有象牙薄片，在2. 5%戊二醛固定液中于4℃固定7 min，然后在0. 25% NH3·H2O溶液中超声清洗1 min，共3次，经系列乙醇脱水，自然晾干后，置甲苯胺蓝染液中，室温下染色3～4 min，蒸馏水清洗后于光镜下对整张象牙薄片上的吸收陷窝进行拍照和计数。

2.8重氮盐法检测OC TRAP活性各组加入相应药物后分别培养24、48和72 h，收集各组OC培养室上清液，按试剂盒说明进行TRAP活性的检测。

2.9RT-PCR检测OB中ERα/β mRNA的表达各组加入相应药物进行培养，当细胞铺满培养板的底面时，弃去培养液，D-Hanks液冲洗3次，用0. 25%的胰蛋白酶将各孔中的OB消化下来，每孔加入1 mL TRIzol裂解细胞，根据TRIzol试剂盒说明书提取总RNA。cDNA的合成采用20 μL逆转录反应体系: 总RNA 2 μL、Oligo 2 μL、dNTP 2 μL、RNase-free ddH2O 7. 5 μL置PCR仪上70℃5 min，后立即于4℃冰浴3 min，再依次加入5×Buffer 4 μL、RNasin 0. 5 μL、0. 1 mol/L DTT 1 μL、RIAScript M-MLV 1 μL 置PCR仪上42℃反应50 min，90℃加热5 min终止反应，所得cDNA在－20℃保存备用。PCR反应总体系( 20 μL) : cDNA 2 μL、上游引物( 50 μmol/L) 1 μL、下游引物( 50 μmol/L) 1 μL、dNTPs ( 10 mmol/ L) 2 μL、10×PCR Bμffer 2. 5 μL、Taq酶( 5 U/μL) 0. 5 μL、ddH2O 11 μL，PCR程序: ERα和ERβ扩增温度参数: 95℃，3 min; 95℃30 s，55℃30 s，72℃30 s，扩增35个循环;末次循环72℃5 min，4℃终止;β-actin扩增温度参数:预变性95℃，3 min; 95℃30 s，54℃30 s，72℃30 s，扩增35个循环;末次循环72℃5 min，4℃终止。PCR产物行2%琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察结果，用凝胶图像分析仪照相，BANDSCAN图像分析软件进行灰度半定量分析。

3统计学处理

采用SPSS 13. 0统计软件处理，多组间比较运用单因素方差分析，两组间比较采用t检验，数据以均数±标准差( mean±SD)表示。以P＜0. 05为差异有统计学意义。

结果

1共育体系中OB的形态

2共育体系中OC的形态

HE染色可见细胞呈油煎蛋形、长条形、漏斗形或不规则形等多种形态;胞体大，多核，一般为3～4个，染为蓝紫色;胞质少，染为淡红色，或无色，见图1B。这说明所培养细胞的形态符合OC形态。

Figure 1.Morphology of OB and OC.A: OB 2 d after inoculation (×100) ; B: HE staining of OC (×400).图1　OB和OC的形态

3梓醇对OB增殖的影响

在OB-OC共育体系中，各个浓度的梓醇对OB干预后，其A值均高于对照组，其中低浓度( 0. 05、0. 1、0. 5和1 mg/L)梓醇组与对照组比较差异有统计学意义( P＜0. 01)，组内各浓度通过两两比较差异有统计学意义;中浓度( 2、5和10 mg/L)梓醇组与对照组比较，其中2 mg/L差异有统计学意义，而5和10 mg/L差异没有统计学意义，组内各浓度通过两两比较差异无统计学意义;高浓度的梓醇组( 20、50、100 mg/L)与对照组相比差异没有统计学意义，见表1。

表1　不同浓度梓醇对OB增殖的影响Table 1.Effect of different concentrations of catalpol on OB proliferation ( Mean±SD.n =6)

4梓醇对OB ALP活性的影响

在共育体系中，梓醇组OB的ALP活性显著高于对照组( P＜0. 01)，见表2。

表2　梓醇对OB ALP活性的影响Table 2.Effect of catalpol ( 0. 05 mg/L) on ALP activity of OB( King unit.Mean±SD.n =6)

5梓醇对OC骨吸收陷窝的影响

在共育体系中，倒置显微镜下观察，可见象牙薄片上有大小不等的椭圆形、圆形、或不规则型的蓝紫色骨吸收陷窝，边界清晰。梓醇组骨吸收陷窝数明显低于对照组( P＜0. 01)，见表3。

表3　梓醇对OC骨吸收陷窝的影响Table 3.Effect of catalpol ( 0. 05 mg/L) on bone resorption pitsof OC ( Mean±SD.n =6)

6梓醇对OC TRAP活性的影响

TRAP活性随着培养时间的延长呈下降趋势，且梓醇组在作用48、72和96 h后，OC的TRAP活性均显著低于对照组( P＜0. 05)，见表4。

表4　梓醇对OC TRAP活性的影响Table 4.Effect of catalpol ( 0. 05 mg/L) on TRAP activity of OC ( U/L.Mean±SD.n =6)

7梓醇对OB ERα/β mRNA表达的影响

梓醇组和对照组经RT-PCR扩增后，均有目的基因ERα和ERβ的条带，片段大小和预期产物相近;对照组ERα mRNA与梓醇组的目的基因无明显差别，而对照组ERβ mRNA表达较梓醇组弱，见图2。经半定量分析，对照组的ERα mRNA的表达与梓醇组比较无显著差别( P＞0. 05)，而梓醇组ERβ mRNA的表达显著高于对照组( P＜0. 01)，见表5。这说明梓醇在共育体系中可以上调OB中ERβ mRNA表达，而对ERα mRNA的作用不显著。

Figure 2.Effect of catalpol on the expression of ERα/β mRNA.M: marker; 1，3，5，7:β-actin; 2，4: ERα; 6，8: ERβ; 1，2，5，6: catalpol group; 3，4，7，8: control group.图2　梓醇对OB ER α、βmRNA表达的影响

表5　各组灰度半定量比值Table 5.Gray semi-quantitative ratio of different groups ( Mean ±SD.n =6)

讨论

在正常生理条件下，骨组织中OB与OC间的功能活动并不是相互孤立存在的，骨组织的代谢依赖这两种细胞相互作用; OB介导的骨形成与OC介导的骨吸收相互偶联，使骨重建处于一种动态平衡中，从而维持机体骨量与骨密度的正常［6］。在骨重建过程中，OB与OC间的功能存在直接或间接的信号交流，其中OPG/RANKL/RANK轴对破骨细胞分化、成熟及骨吸收功能发挥着重要作用，是OB和OC之间信号交谈的重要转导通路［7］。在骨重建逆转过程中，即骨吸收向骨形成转化过程中，OC分泌转化生长因子-β、骨形态发生蛋白、胰岛素样生长因子等是OB活化的关键［8］。本实验重视OB和OC两者之间的相互作用，采用平面式OB-OC共育模型，能在倒置显微镜下观察2种细胞的情况，可同时收集两室的细胞进行定量学指标的检测;中间隔膜的孔径为0. 45 μm，蛋白质可以自由通过，而OB和OC因直径在30 μm以上，不能越过隔膜，这种细胞间液可以相互交流但细胞互不接触的共育模型具有实际意义。

OB的增殖率能直接反映OB的生长情况，是促骨形成药物药效评价的基本指标。实验结果表明:与对照组相比，梓醇干预后OB的增殖率明显升高，呈现一定的剂量依赖性，其中0. 05～2 mg/L的梓醇组作用显著，且以0. 05 mg/L梓醇组中的A值明显高于其它浓度组，说明0. 05 mg/L梓醇OB增殖的能力明显高于其它浓度组，5～100 mg/L的梓醇对OB增殖也无明显作用，提示随着梓醇浓度的升高，梓醇促进OB的增殖的能力下降，推测低浓度的梓醇对OP患者OB数量下降可能具有一定的改善作用。ALP是一种普遍存在的细胞内酶。在骨代谢异常和骨病中ALP活性可作为OB功能及分化的指标之一。ALP在细胞中的表达多少，可反映出OB的分化程度和功能状态，ALP活性越高，说明前成骨细胞向成熟的OB分化得越明显［9］。实验结果显示梓醇组中OB的ALP活性与对照组相比有显著的统计学意义，说明梓醇能够提高OB ALP的活性，促进OB的分化。实验结果与Oh等［5］报道的地黄提取物能提高OB的增殖及OB中ALP的活性相一致。提示梓醇可能是地黄防治OP的有效成分之一。

骨吸收陷窝是OC骨吸收的直接结果，其陷窝数量、大小和深度直接反映了OC的骨吸收能力［10］。因此观察骨吸收陷窝的形态和测量陷窝的数量、大小是检测OC骨吸收功能的可靠指标。本实验结果显示，在OB-OC共育体系中不同浓度的梓醇对OC骨吸收陷窝形成数目明显低于对照组。说明梓醇对OC活性有直接的抑制作用。TRAP是OC释放入循环系统，直接参与OC骨吸收过程中的一种溶酶体，其可以降解骨内固体钙磷矿化物，TRAP的出现标志着OC的形成和OC活动的开始，并在一定程度上反映了骨吸收状况［11-12］。本实验结果表明，在OB-OC共育体系中，随着培养时间的延长，梓醇组和对照组TRAP活性都有所降低，提示随着培养时间延长，OC分泌TRAP的数量和活性在下降;但在同一时段，梓醇组TRAP活性都明显低于对照组，说明梓醇具有抑制OC分泌TRAP的能力。

梓醇是一种环烯萜类物，是从地黄中提取出来的主要有效成分之一。曲有乐等［13］采用体内动物实验研究发现，熟地黄能显著对抗老年进程中OB孕激素受体的下降，从而对抗OP的发生，说明地黄中的某种成分具有类雌激素的作用。本实验通过RTPCR的方法发现，体外培养的OB在功能表达过程中均能检测到ERα mRNA和ERβ mRNA的RT-PCR的产物，且ERβ mRNA的表达要高于ERα mRNA，加入梓醇后，OB中ERβ mRNA的表达水平均显著提高，与对照组相比有统计学意义，而ERα mRNA表达无明显差异，提示梓醇能够上调ERβ mRNA的表达，其原因可能与ERβ mRNA在OB中的表达高于ERα mRNA有关，这与雌激素对骨形成的作用主要是由ERβ调控的观点相一致［14］。本实验提示梓醇可能具有类雌激素样作用，对此，还有待进一步研究证实。

综上所述，我们认为梓醇在OB-OC共育体系中能够刺激OB的增殖、提高OB ALP活性，并同时抑制OC活性，上调OB ERβ mRNA的表达水平。梓醇可能是地黄防治OP的有效成分之一。

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Effect of catalpol on activity of osteoblasts/osteoclasts and osteoblast ERα/β mRNA expression in osteoblast-osteoclast co-culture system

LAI Man-xiang1，2，YANG Li2，ZHANG Rong-hua2
(1Guangdong Food and Drug Vocational College，Guangzhou 510520，China;2Pharmacy College of Jinan University，Guangzhou 510632，China.E-mail: tzrh@ jnu.edu.cn)

［ABSTRACT］AIM: To investigate the effect of catalpol on the activity of osteoblasts ( OB) and osteoclasts ( OC)，and OB estrogen receptor ( ER)α/β mRNA expression in the OB-OC co-culture system.METHODS: OB and OC were isolated from the SD rats of 1 and 5 days old.In the OB-OC co-culture system，different concentrations of catalpol including low dosage ( 0. 05，0. 1，0. 5 and 1 mg/L)，middle dosage ( 2，5 and 10 mg/L)，and high dosage ( 20，50 and 100 mg/L) were added into the culture medium to detect the changes of OB proliferation by MTT assay.The catalpol at maximal dosage was added to OB section to detect the alkaline phosphatase ( ALP) activity of OB by pNPP method.The mRNA expression of ERα/β in the OB treated with catalpol in the co-culture system was detected by RT-PCR.The catalpol at maximal dosage was added to OC group to detect the activity of OC by microscopy and tartrate-resistantacid phosphatase ( TRAP) activity detection.RESULTS: In 0. 05～2 mg/L catalpol groups，the proliferation of OB was significantly increased as compared with control group in the co-culture system，and it reached the maximum value when catalpol was at 0. 05 mg/L，while in 5～100 mg/L catalpol groups，the proliferation of OB was not increased.The ALP activity of OB in 0. 05 mg/L catalpol group was higher than that in control group.The catalpal at 0. 05 mg/L promoted the mRNA expression of ERβ in OB in the co-culture system，but did not increase the mRNA expression of ERα as compared with control group.Catalpol at 0. 05 mg/L obviously inhibited the bone resorption and the TRAP activity in OC.CONCLUSION: Catalpol stimulates the proliferation and activity of OB，inhibits the bone resorption and activity of OC，and increases the mRNA expression of ERβ in OB in the OB-OC co-culture system，suggesting that high mRNA expression of ERβ may be the regulatory pathway of catalpol in response to bone metabolism.

［KEY WORDS］Catalpols; Osteoblasts; Osteoclasts; Estrogen receptors

通讯作者△Tel: 020-85220023; E-mail: tzrh@ jnu.edu.cn

*［基金项目］国家自然科学基金资助项目( No.81473509; No.81173619)

［收稿日期］2015-01-07［修回日期］2015-03-27

［文章编号］1000-4718( 2015)07-1242-05

［中图分类号］R363

［文献标志码］A

doi:10.3969/j.issn.1000-4718.2015.07.016