张　瑛，夏学颖，王春筱，王晓红，邹和群△(南方医科大学第三附属医院肾内科，广东广州5060;广东省妇幼保健院整形外科，广东广州5000;中山大学眼科中心，广东广州50060)

MADPH氧化酶抑制剂对晚期氧化蛋白产物诱导内皮细胞高通透性的影响及机制*

张瑛1，夏学颖2，王春筱3，王晓红1，邹和群1△
(1南方医科大学第三附属医院肾内科，广东广州510630;2广东省妇幼保健院整形外科，广东广州510010;3中山大学眼科中心，广东广州510060)

［摘要］目的:探讨NADPH氧化酶( Nox)抑制剂对晚期氧化蛋白产物( AOPP)刺激下血管内皮的保护作用。方法:体外培养人脐静脉内皮细胞进行实验，人血清白蛋白( HSA)作为阴性对照，用不同浓度( 50、100和200 mg/L) AOPP-HSA共同孵育8 h后，利用5-氯甲基二乙酸荧光素标记人急性单核细胞白血病细胞株THP-1的细胞渗出数量反映内皮细胞的通透性，研究不同浓度AOPP-HSA对单层细胞通透性的影响。此外，另将细胞分为HSA组、AOPP-HSA组和AOPP-HSA +二联苯碘( DPI)组，进而探讨AOPP-HSA对Nox活化水平的影响以及DPI对内皮细胞骨架重构和细胞通透性改变的作用。结果: AOPP-HSA可使血管内皮细胞通透性明显增加( P＜0. 05)。AOPP-HSA可导致Nox磷酸化水平上升，并呈剂量依赖性。Nox抑制剂DPI预处理组可抑制AOPP-HSA刺激下Nox磷酸化水平的上升，从而抑制血管内皮细胞通透性增加及细胞骨架重构。结论: AOPP-HSA可通过激活Nox导致血管内皮细胞通透性受损，Nox抑制剂DPI可以降低其通透性及细胞骨架重构，起到一定的保护作用。

［关键词］NADPH氧化酶;晚期氧化蛋白产物;内皮细胞;氧化应激;细胞通透性

慢性肾脏病( chronic kidney disease，CKD)是威胁人类健康的一类重大疾病，其发病率高，危害大［1］。目前，CKD已成为中国严重的公共卫生问题［2］。心血管疾病是CKD患者主要的死亡原因，据统计，大于50%的肾病患者死于心血管疾病，而其病理变化主要为动脉粥样斑块形成［3］。内皮作为血管系统的屏障，内皮氧化应激损伤被视为动脉粥样硬化的始动环节［4］。

还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸( reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH)氧化酶( NADPH oxidase，Nox)作为一种广泛存在的过氧化物酶，是由膜亚基gp91phox和p22phox，以及胞浆内亚基p47phox、p67phox、p40phox和小分子GTPases结合蛋白Rac等组成的酶复合体，在人体多种组织内催化产生活性氧，参与介导氧化应激损伤。在血管细胞中，Nox受一系列与动脉粥样硬化有关的病理生理刺激物的调节［5］。在近期的研究显示晚期氧化蛋白终产物( advanced oxidation protein products，AOPP)可能与加速性动脉硬化有关，是动脉粥样硬化发展过程中的关键致病因子［6］。本研究利用5-氯甲基二乙酸荧光素( 5-chloromethylfluorescein diacetate，CMFDA)标记人急性单核细胞白血病( human acute monocytic leukemia)细胞株THP-1的渗出数量反映内皮细胞的通透性，观察不同AOPP-人血清白蛋白( human serum albumin，HSA)对人脐静脉内皮细胞( human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)通透性的损伤情况，同时研究Nox抑制剂二联苯碘( diphenyleneiodonium，DPI)对于通透性损伤的影响作用，为进一步研究AOPP-HSA诱导血管内皮细胞屏障功能受损的作用机制奠定基础。

材料和方法

1材料

健康产妇正常分娩新生儿脐带; HSA、牛血清白蛋白( bovine serum albumin，BSA)和D-葡萄糖( Sigma) ;胰蛋白酶( Amersco) ;罗丹明-鬼笔环肽和CMFDA购自Invitrogen; Nox抑制剂DPI( Millipore) ; RPMI-1640培养基、胎牛血清和小牛血清( Gibco) ; Transwell板( BD) ;兔抗p47phox抗体( Millipore) ;免抗p-p47phox( Ser)抗体( Abcam) ;兔抗β-actin多克隆抗体和羊抗兔II抗(北京中杉金桥公司)。

2方法

2.1细胞培养( 1) HUVECs的培养:无菌条件下，取新鲜新生儿脐带20～35 cm( 4℃保存不超过12 h)，按照Jaffe等［6］的方法分离培养HUVECs，在37℃、5% CO2条件下培养，用原代或第2代细胞进行实验。( 2) THP-1细胞的复苏、培养: THP-1细胞采用ATCC细胞株，复苏后在37℃、5% CO2条件下含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液培养。

2.2AOPP-HSA的制备按文献方法体外制备AOPP-HSA修饰蛋白［7］。将20 g/L HSA与40 mmol/L次氯酸等体积混合，室温放置30 min，制备出HSA与次氯酸摩尔比为1∶140的AOPP-HSA。制备的AOPP-HSA在无内毒素PBS中透析24 h，除去游离的次氯酸。用0. 22 μm的微孔滤膜过滤除菌后4℃保存。20 g/L HSA与PBS等体积混合，作为对照。AOPP-HSA和未经修饰的HSA的蛋白浓度分别为7. 13 g/L和10. 3 g/L。AOPP-HSA含量通过测定酸性条件下340 nm的光吸收，以氯胺T为标准取得。

2.3AOPP-HSA对HUVECs单细胞层的通透性影响为研究不同浓度的AOPP-HSA对于HUVECs单细胞层的通透性变化，按不同浓度分组干预处理，可分为: ( 1)对照组，为RPMI-1640培养基培养; ( 2) HSA组，为RPMI-1640培养基+ HSA( 200 mg/L) ; ( 3) AOPP-HSA刺激组，为分别含AOPP-HSA( 50、100和200 mg/L)的RPMI-1640培养基。根据实验结果，采用200 mg/L的AOPP-HSA为最佳浓度刺激组，进一步探讨Nox抑制剂DPI对于通透性改变的作用。实验分为HSA组、AOPP-HSA组和AOPPHSA + DPI组(采用100 μmol/L DPI预处理1 h)。

2.4Transwell实验检测内皮细胞通透性按照我们之前报道的方法进行［8］，将HUVECs按1×105/ cm2接种于嵌套小室的滤膜上，细胞生长至融合，分别与50、100和200 mg/L的AOPP-HSA刺激8 h，200 mg/L的HSA作为阴性对照。将生长状态良好的THP-1细胞离心收获细胞，用无血清培养基重悬细胞，THP-1细胞在无血清培养基中培养24 h。吸走上清，用预温好的工作液轻轻重悬细胞，将细胞放在培养箱培养45 min。离心收获细胞，移走工作液，用预温的PBS洗细胞，离心收获细胞，用新鲜的无血清培养基重悬THP-1细胞，均匀在各组加入200 μL的悬液，细胞计数达每孔105个，下室加入20%胎牛血清的RPMI-1640培养基，共同孵育3 h。计数:移走上室，荧光显微镜下计数进入下室的THP-1细胞数。每组随机选择5个视野，计数求均值。

2.5 AOPP-HSA对HUVECs细胞骨架重构的影响

HUVECs接种至置有盖玻片的6孔细胞培养板上，细胞生长至融合，在无血清的RPMI-1640培养基中静置12 h后，与DPI预孵育1 h后，加入200 mg/L的AOPP-HSA孵育8 h，以200 mg/L的HSA作为对照。刺激结束，PBS洗细胞3次。吸出PBS，固定、封闭、透化、染色、封片。在免疫荧光显微镜下观察、摄像。

2.6Western blot法检测蛋白水平HUVECs接种于6孔板上，细胞生长至融合，无血清RPMI-1640培养基中静置12 h，根据实验分组分别加入200 mg/L 的HSA作为对照，200 mg/L的AOPP-HSA，于15 min收集细胞;在阻断实验中，HUVECs与DPI ( 100 μmol/L)预孵育1 h后，加入200 mg/L的AOPP-HSA刺激15 min后收集细胞，提取蛋白。免疫沉淀、Western blot检测p-p47phox( Ser)和p47phox蛋白含量。各组分别取100 μL蛋白，加入400 μL PBS、10 μL agarose和5 μL p47phox，混匀，4℃摇荡过夜; 12 000 r/min 4℃离心5 min，弃上清，用IP洗液洗3次(每次5 min)，离心，弃上清;每管加入20 μL 2×上样缓冲液及3 μL 1 mol/L DTT，煮沸5 min，离心。灌制10%的分离胶和5%的浓缩胶，加样。电泳、转膜、封闭、显影、定影。凝胶图像分析系统分析结果。

2.7p47phox膜迁移测定用免疫荧光化学染色法测定p47phox膜迁移［8］。细胞培养于置有盖玻片的细胞培养板，生长至70%融合，静止后，用200 mg/L AOPP-HSA或未经修饰的HSA刺激细胞15 min。固定、漂洗、封闭后，加入小鼠抗p47phox抗体( 1∶50)，4℃过夜，FITC标记兔抗小鼠Ⅱ抗( 1∶20) 37℃避光孵育45 min。漂洗，PI( 10 mg/L)室温避光孵育10 min。荧光显微镜下摄像。

3统计学处理

采用SPSS 13. 0统计软件进行统计学分析。所有数据均以均数±标准差( mean±SD)表示，多个样本均数的比较采用单因素方差分析( one-way ANOVA)，组间两两比较采用LSD法。以P＜0. 05为差异有统计学意义。

结果

1内皮细胞通透性的变化及Nox抑制剂DPI对于AOPP-HSA导致的内皮细胞通透性增加的影响

荧光显微镜下观察CMFDA标记的THP-1细胞带绿色荧光，呈圆形，散在分布于Transwell模型的下室。不同浓度的AOPP-HSA与内皮细胞共培养8 h后，进入下室的THP-1细胞的数目与浓度呈正相关，均与对照组有显著差异( P＜0. 05)，且在200 mg/L达高峰，见图1。

Figure 1.The effect of AOPP-HSA on the permeability of HUVECs.Mean±SD.n = 3.＊＊P＜0. 01 vs control group.图1　AOPP对内皮细胞通透性的影响

根据实验结果采用200 mg/L的AOPP-HSA为最佳浓度刺激组。用Nox抑制剂DPI( 100 μmol/L)预处理1 h后，再加入AOPP-HSA刺激( 200 mg/L) 15 min，进一步测定内皮细胞通透性。镜下观察发现，AOPP-HSA + DPI组与AOPP-HSA组相比通透性明显降低，两两比较差异显著( P＜0. 01)，见图2。

2内皮细胞骨架重构及Nox抑制剂DPI对于AOPP-HSA导致的内皮细胞骨架重构的影响

AOPP-HSA增加应力纤维的形成，HUVECs与200 mg/L AOPP-HSA共同孵育0或8 h，荧光显微镜下观察，在正常情况下F-actin主要分布在细胞周边，线条光滑，完整连续，界限分明，称为外周致密束;作用8 h后F-actin变得不光滑，成锯齿样分布，细胞收缩。而200 mg/L HSA则对应力纤维的形成没有影响。而DPI则可以减少AOPP-HSA导致应力纤维的形成，见图3。

3 AOPP-HSA对内皮细胞Nox磷酸化水平的影响

AOPP-HSA刺激可活化Nox，AOPP-HSA组内皮细胞中Nox p47phox总蛋白水平变化不明显，而Nox p47phox磷酸化水平与对照组相比差异显著( P＜0. 01)。Nox抑制剂DPI预处理1 h后再加AOPPHSA刺激( 200 mg/L)，可明显降低p47phox磷酸化水平( P＜0. 01)，见图4。

Figure 2.The effect of DPI on the permeability of HUVECs (×400).Mean±SD.n =3.＊＊P＜0. 01 vs HSA group;##P＜0. 01 vs AOPP－HSA group.图2　氧化酶抑制剂DPI对于AOPP-HSA导致的内皮细胞通透性增加的影响

Figure 3.The effect of AOPP-HSA on the rearragement of cystoskeleton in the HUVECs (×400).图3　AOPP对细胞骨架重构的影响

4 AOPP-HSA对p47phox膜迁移的影响

免疫荧光结果显示，与未经修饰的HSA相比，200 mg/L AOPP-HSA刺激细胞15 min，可诱导p47phox明显膜迁移，见图5。

讨论

慢性肾脏病是严重危害人类健康的常见病，已成为全球公共健康问题。流行病学资料显示，心血管疾病是CKD最常见的严重并发症。CKD患者动脉粥样硬化的发生率较同一年龄人群高5～10倍，发病年龄提前至30～40岁，称为加速型动脉硬化。CKD患者动脉粥样硬化快速发生、发展的原因目前尚未阐明。

近年来，AOPP作为一种新型的炎症介质引起了广泛关注，与多种疾病密切相关［9-11］。研究提示AOPP修饰蛋白可能是动脉粥样硬化发展过程中的关键致病因子［6］。我们CMFDA标记THP-1细胞的渗出数量反映内皮细胞的通透性，观察不同浓度AOPP-HSA对人脐静脉内皮细胞单层细胞间通透性的损伤情况。从实验结果来看，内皮细胞经AOPPHSA作用后，内皮细胞通透性增加并与浓度呈正相关，而未经氧化修饰的HSA则无上述作用。我们再用免疫荧光法观察到AOPP-HSA组的应力纤维形成明显增加，而应力纤维的形成使得细胞间的间隙增大，使得内皮细胞的联系不紧密，最终导致内皮细胞的通透性增加。内皮细胞通透性增加即内皮细胞屏障受损，而这也是动脉粥样硬化早期病理改变基础。

Figure 4.The effect of AOPP-HSA on Nox phosphorylation in HUVECs.Mean±SD.n =3.＊＊P＜0. 01 vs HSA group;##P＜0. 01 vs AOPP-HSA group.图4　AOPP对Nox磷酸化水平的影响

Figure 5.The effect of AOPP-HSA on p47phoxmigration (×400).图5　AOPP对p47phox膜迁移的影响

过多活性氧的生成可能在动脉粥样硬化发生中起很大的作用［12］，Nox及其催化亚单位是唯一已知的仅仅产生活性氧的酶家族［13］。糖尿病患者加速性动脉粥样硬化的机制尚未阐明，但过多ROS的生成在其中起到了主要的作用［14］。此外，AOPP触发脂肪细胞炎症反应依赖于Nox产生活性氧［15］。这些都提示AOPP可能通过Nox依赖的信号通路导致内皮细胞功能受损。为了进一步探讨AOPP-HSA诱导内皮细胞通透性增加的机制，我们用200 mg/L的AOPP-HSA作为刺激物，并用Nox特异性抑制剂DPI预处理细胞观察是否能阻断上述效应。结果显示，在AOPP-HSA的作用下，Nox激活，p47phox迅速出现磷酸化和膜迁移，应力纤维形成增加，内皮细胞的通透性明显增高。Nox的特异性抑制剂DPI可减弱这一效应的产生。提示AOPP-HSA激活Nox导致血管内皮细胞的通透性增高，并且这种作用是由于白蛋白氧化修饰所致而非白蛋白本身。之前已有研究证实晚期糖基化终产物可引起内皮细胞的氧化应激导致血管内皮细胞通透性增加［16］，本研究证实AOPP是通过依赖于Nox的信号途径导致内皮细胞受损，这也印证了AOPP具有与晚期糖基化终产物相似的生物学活性［15，17-19］。

综上所述，AOPP-HSA通过Nox依赖的信号途径诱导血管内皮通透性增高，可能是CKD患者血管并发症发生和发展的重要因素。因此，对Nox激活的干预可能改善内皮炎症反应和内皮功能失常，延缓和逆转血管并发症。

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Protective effect of diphenyleneiodonium，a NADPH oxidase inhibitor，on hyperpermeability of endothelial cells exposed to AOPP-HSA in vitro

ZHANG Ying1，XIA Xue-ying2，WANG Chun-xiao3，WANG Xiao-hong1，ZOU He-qun1
(1Department of Nephrology，The Third Affiliated Hospital of Southern Medical University，Guangzhou 510630，China;2Department of Plastic Surgery，Guangdong Women and Children Hospital，Guangzhou 510010，China;3Zhongshan Ophthalmic Center，Sun Yat-sen University，Guangzhou 510060，China.E-mail: hequnzou@ hotmail.com)

［ABSTRACT］AIM: To investigate the effect of advanced oxidation protein product-human serum albumin ( AOPP-HSA) at different concentrations on the permeability of human umbilical vein endothelial cell ( HUVEC) monolayer and the protective effect of NADPH oxidase inhibitor diphenyleneiodonium ( DPI) against AOPP-HSA exposure.METHODS: Cultured HUVECs were exposed to 200 mg/L HSA ( control) or AOPP-HSA ( 50，100 and 200 mg/L).The permeability of the endothelial monolayer was assessed by measuring CMFDA-labeled THP-1 cells across the endothelial cells.The cultured HUVECs were treated with HSA ( 200 mg/L)，AOPP-HSA ( 200 mg/L)，or AOPP-HSA ( 200 mg/L) + DPI ( 100 μmol/L)，and the activation of NADPH oxidase，endothelial monolayer permeability and cytoskeleton rearrangement were evaluated.RESULTS: AOPP-HSA increased the permeability of the endothelial cell monolayer，and AOPP-HSA at 200 mg/L significantly increased the phosphorylation level of NADPH oxidase in the cells.Treatment with 100 μmol/L DPI obviously attenuated AOPP-HSA-induced NADPH oxidase activation，the increase in the permeability of the cell monolayer and the cytoskeleton rearrangement.CONCLUSION: AOPP-HSA increases the hyperpermeability of HUVEC monolayer via the phosphorylation of NADPH oxidase，and the NADPH oxidase inhibitor DPI reverses such effects.

［KEY WORDS］NADPH oxidase; Advanced oxidation protein products; Endothelial cells; Oxidative stress; Permeability

通讯作者△Tel: 020-62784398; E-mail: hequnzou@ hotmail.com

*［基金项目］广东省医学科研基金资助项目( No.B2012244) ;南方医科大学青年科技人员培育项目( No.201201547) ;南方医科大学第三附属医院院长基金资助项目( No.B20111109)

［收稿日期］2014-11-24［修回日期］2015-04-21

［文章编号］1000-4718( 2015)07-1172-06

［中图分类号］R363

［文献标志码］A

doi:10.3969/j.issn.1000-4718.2015.07.004