李鹏，于永慧，王涛，何君，朱虹，端青，宋立华

1.病原微生物生物安全国家重点实验室，军事医学科学院 微生物流行病研究所，北京 100071；

2.解放军第264医院，山西 太原 030001

沙眼衣原体（Chlamydia trachomatis，Ct）是沙眼和最常见的细菌性性传播疾病的病原体。在我国，致盲性沙眼已多年未见报道，Ct导致的泌尿生殖道感染是常见病，特别是女性感染Ct后易发生盆腔炎、流产、不孕不育等。近年来有报道称Ct感染还可能是宫颈癌的又一病因。由于Ct为专性细胞内寄生，培养和纯化困难，Ct疫苗研究一直进展缓慢。近年来Ct减毒活疫苗研究有突破，在短尾猴沙眼模型上质粒缺失的Ct A2497株是良好的沙眼减毒活疫苗[1]。在小鼠模型上，Ct L2型、F型和鼠衣原体（与Ct亲缘性最高的动物衣原体）的质粒缺失株也已减毒，这说明质粒是Ct的关键毒力因子[2-4]。

质粒缺失Ct的共有表型是包含体中无糖原积累。Ct质粒约7.5 kb，编码8个蛋白（Pgp1～Pgp8），其致病机制主要是通过Pgp4调控Pgp3及至少8个染色体基因（包括糖原合成酶基因glgA、CT084）的转录表达[5]。Pgp4的调控机制还不清楚。有意思的是，Koo等报道了ChxR在大肠杆菌系统中可以激活转录质粒调节基因CT084[6]。ChxR是保守的衣原体蛋白，Koo等认为是衣原体特定发育时期的全局转录调控因子，可能与衣原体的潜伏感染相关，而质粒缺失的A2497的典型感染特征是短时感染。这都说明ChxR可能也参与Pgp4调节基因的转录调控。

ChxR是保守的衣原体蛋白，与大肠杆菌双组分信号转导系统的CpxR同源，但它不含天门冬氨酸磷酸化位点，是非典型的OmpR/PhoB家族的反应调节蛋白。这类调控因子存在于衣原体、螺杆菌、粘球菌、链霉菌和聚球藻中，其转录调节活性不受磷酸化调控，作用机制还不清楚。ChxR是自身激活转录因子[7]，其结构已被解析[8-9]，但对其调控靶标和机制的了解仍很有限。我们利用凝胶阻滞实验，分析ChxR与4个Pgp4调节基因上游区的相互作用，有助于理解衣原体质粒及ChxR的转录调控机制。

1 材料与方法

1.1 材料

沙眼衣原体 L2（434），大肠杆菌 DH5α、BL21（DE3），载体pCR2.1、pET-21b由本室保存；限制性内切酶、高保真DNA聚合酶为NEB公司产品；DNA提取试剂盒、质粒纯化试剂盒、PCR产物纯化试剂盒为Qiagen公司产品；LightShift化学发光EMSA试剂盒、DNA 3'端生物素标记试剂盒购自Thermo Fish⁃er Scientific公司；TALON金属亲和介质购自Clon⁃tech公司。

1.2 ChxR的重组表达和纯化

以沙眼衣原体L2（434）基因组为模板，采用引物 ChxRf（CCggAATTCggCggggCCTAAACATgTg）、ChxRr（CCgCTCgAgTCTAgAAAgCTTTgTATCTTgTTg Ag）和高保真DNA聚合酶扩增ChxR基因。PCR产物经EcoRⅠ和XhoⅠ酶切后，与经同样酶切处理的载体pET-21b连接，产物转化大肠杆菌BL21（DE3），于37℃在含100 μg/mL青霉素的LB培养基中培养至 D600nm为 0.8，加入 1 mmol/L IPTG 继续培养 2 h后，用TALON介质纯化重组蛋白（洗脱蛋白中加入25%甘油，-80oC冻存）。

1.3 衣原体基因上游序列的探针制备

以L2（434）基因组为模板，用表1中的引物和高保真DNA聚合酶扩增5个基因（glgA、CTL0071、CTL0305、CTL0339、chxR）的上游序列（约150 bp），将PCR产物克隆入载体pCR2.1，经测序验证插入序列后摇菌纯化重组质粒，用BstXⅠ单酶切将质粒分割为载体序列和插入序列2个片段，该DNA混合物直接进行3'端生物素标记，氯仿异戊醇抽提后，加无核酸酶水将插入序列亦即探针的浓度稀释至50 fmol/μL，-20oC保存。

1.4 引物延伸实验

用引物TTACATTTAAggggCATCTTACC和CTC CCAggCCTCCggCTTT（与glgA mRNA互补），PCR扩增glgA的上游序列和部分ORF序列共289 bp，扩增产物纯化后作为测序模板。将与mRNA互补的引物的5'端用［γ-32P］ATP（5000 Ci/mmol）进行放射性标记，退火后用逆转录酶合成cDNA。逆转录产物与mRNA互补引物的测序条带进行8 mol/L尿素-6%聚丙烯酰胺凝胶电泳，放射自显影后，通过引物延伸条带的位置确定转录起始位点。

1.5 寡核苷酸探针制备

为鉴别ChxR与glgA上游序列的结合位点，设计合成5条60 bp的寡核苷酸探针，每条探针有30 bp的重叠序列（转录因子的核酸结合序列通常小于30 bp），共覆盖了ATG上游150 bp长度。探针均为双链，由2条3'端标记生物素的单链DNA等比例混合后缓慢退火制成。本研究所需引物或探针均由Life Technologies公司合成。

1.6 凝胶阻滞实验

所有操作按照LightShift化学发光EMSA试剂盒（含化学发光核酸检测模块）的操作说明书进行。反应体系：1 μL重组ChxR（500 ng，含25%甘油），1×结合缓冲液，2.5%甘油，5 mmol/L MgCl2，50 ng/μL Poly（DI-DC），0.05%NP-40，4 pmol/L未标记探针，20 fmol/L标记探针，加双蒸水至10 μL总体积。

2 结果

2.1 ChxR的重组表达和纯化

在大肠杆菌中，重组ChxR若在自身ORF的ATG起始翻译时，重组蛋白几乎全部形成包含体，不利于蛋白纯化；若利用pET-21b载体的ATG起始翻译，则蛋白的溶解性明显提高，可获得高纯度的重组蛋白（图1）。重组ChxR的N端有T7标签，C端有6×His标签，可用TALON试剂较好地得到纯化。纯化的重组蛋白在冻存前要加入终浓度为25%的甘油，否则会形成聚体沉淀，这可能与此蛋白易形成二聚体有关。图1中第1次洗脱的ChxR浓度约为500 ng/μL，其浓度和纯度均满足凝胶阻滞实验的要求。

表1 构建glgA、CTL0071、CTL0305、CTL0339、chxR探针的各组引物

2.2 质粒调控基因的上游区含有多个ChxR结合位点

为鉴定ChxR是否与质粒调控基因的上游序列有相互作用，我们利用上述纯化的重组ChxR进行了凝胶阻滞实验（图2）。文献已报道ChxR是自身激活转录因子[7]，可识别并结合自身基因的上游区，我们因此以chxR上游区作为阳性对照探针。另外，Koo等报道ChxR可激活CTL0339（CT084）的转录[6]，CTL0339探针也因此应与ChxR存在相互作用。图2中chxR探针有4条明显的阻滞条带，这与文献报道一致。让人吃惊的是，质粒调控基因的上游区也有3～6条不等的阻滞带，其中glgA、CTL0071、CTL0305和CTL0339探针的阻滞条带数分别为6、4、3和5条，说明这几个基因的上游区含有多个ChxR结合位点，ChxR可能参与这几个基因的转录调控。

2.3 引物延伸实验结果

糖原合成代谢在衣原体中高度保守，很可能为衣原体的潜伏感染提供关键能量；另外糖原合成酶基因glgA是惟一功能明确的质粒调控基因，我们因此重点探索了ChxR与glgA的转录之间的可能机制。首先利用引物延伸实验鉴定了glgA的转录起始位点（transcriptional start site，TSS），这对下一步理解ChxR与glgA上游区的相互作用很关键。基于生物信息学预测，glgA上游区有一个σ70启动子（TTg ATTATTTTTgTTAAAAgAAATAAT），其TSS因此可能位于-31（glgA ORF中ATG的A设为+1位，以下均同）（图3）。引物延伸实验所需的引物因此设计在此位点的下游75 bp处，实验结果表明glgA的TSS位于-54位，这与推测的TSS不同（图4）。此TSS位于回文序列内部，其转录起始可能受阻遏蛋白调控。

图1 亲和层析纯化的重组ChxR电泳图谱M：Precision plus protein prestained standards；1～4：分别为层析柱的第1～4次洗脱结果

2.4 glgA启动子的上下游区均有ChxR结合位点

为定位ChxR与glgA上游区的结合位点，我们设计了5条长60 bp、重叠30 bp的寡核酸探针，根据TSS推测的启动子位于第2和第3条探针（图5A）。图5B结果表明探针1～5分别有2、2、1、0和1条阻滞条带，很明显多数ChxR结合位点位于启动子和启动子下游区。虽然文献报道ChxR是全局转录增强子，但本实验强烈提示ChxR可能是glgA的转录抑制子。

3 讨论

衣原体感染特别是沙眼衣原体感染是临床常见病，常导致沙眼、不孕不育、动脉粥样硬化、肺炎等。衣原体的致病机制仍有待探讨，最新研究表明衣原体质粒蛋白Pgp4调控的染色体基因与致病性紧密相关。即使在质粒缺失的衣原体毒株如肺炎衣原体和鹦鹉热衣原体中，这些染色体基因同样保守存在。这些染色体基因的致病机理是目前衣原体领域的研究热点。本研究探索了这些染色体基因的转录调控与转录调控因子ChxR间的关联。

图2 凝胶阻滞实验

图3 生物信息学预测的glgA启动子和转录起始位点pgsA、glgA、tRNA示衣原体基因的位置和方向；下面的核酸序列标注了预测的glgA启动子、TSS、RBS（核糖体结合位点）和TL（翻译起始位点）

Pgp4调控染色体基因表达的机制和ChxR的功能都还不清楚，我们通过体外凝胶阻滞实验发现Pgp4调控的4个染色体基因的上游区有多个ChxR结合位点，提示ChxR参与这些染色体基因的转录调控；通过鉴定glgA mRNA的转录起始位点和设计寡核苷酸探针进行凝胶阻滞实验，我们进一步发现ChxR在glgA转录中可能起到阻遏蛋白的作用。这些研究提示glgA的转录表达可能是多个转录调控因子协同作用的结果。

图4 引物延伸实验

图5 寡核苷酸探针oligo1～5与ChxR的凝胶阻滞实验A：oligo1～5为5条寡核苷酸探针，其中1号探针紧邻glgA ORF；B：oligo1～5分别有2、2、1、0和1条阻滞条带

本研究除了提示ChxR参与质粒调控基因表达外，重要的是发现ChxR有广泛的DNA结合活性，但我们没能找到其识别结合的DNA序列特征，很可能有更多的基因受其调控。我们的实验结果支持ChxR可能是全局调控因子，该蛋白可能同时为转录增强子和抑制子。新出现的衣原体遗传操作技术为下一步深入研究ChxR和Pgp4协同调控基因转录的机制提供了重要工具[5,10-13]。

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