李金松，麻粉莲，张骞，郑丽舒

中国疾病预防控制中心 病毒病预防控制所，北京 100052

白细胞介素（interleukins，IL）是指在白细胞或免疫细胞间相互作用的淋巴因子，具有重要的免疫调节作用。白细胞介素7（IL-7）是由肠道上皮细胞，淋巴结的滤泡树突状细胞和网状纤维细胞，脾、骨髓和胸腺等基质细胞产生的一种多功能细胞因子[1-2]。IL-7通过CD127和CD132受体复合物激活Janus激酶（JAK）1/JAK3信号，激活信号转导及转录活化蛋白5（STAT5）和磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）提高抗凋亡蛋白表达等，来提高T细胞分化发育、成熟的T细胞的存活和胸腺输出新生的T细胞，因此对T细胞的细胞稳态起关键作用[3-5]。不仅能够促进免疫系统恢复，还可以消除慢病毒或肿瘤引起的免疫耐受。αβ-T细胞对一些蛋白、病毒慢性感染或肿瘤等免疫反应较弱，但IL-7能增强这种免疫反应。尽管高效的抗病毒治疗已显著降低了HIV感染的发病率和死亡率，并且病毒被持续抑制，但大部分接受抗病毒治疗的患者CD4+T细胞恢复较差。近期的研究证明，IL-7能够通过提高幼稚T细胞和组织中的T细胞恢复，显著提高HIV感染者的T细胞系统重建[6-7]。

位点特异重组可以克服随机整合效率低等问题，其中酵母的FLP/FRT系统是常见的位点特异性重组工具，并被广泛应用。Invitrogen公司的Flp-In重组系统通过pOG44质粒产生重组酶，将表达外源蛋白的pcDNA5/FRT整合于Flp-In-CHO细胞，该细胞在基因组活性区整合了相应的FRT位点。在此，我们利用Flp-In-CHO细胞表达人IL-7，并对其相关功能做了初步研究，为其药物开发和应用提供基础。

1 材料与方法

1.1 材料

Flp-In-CHO细胞、CellTrace CFSE Cell Prolif⁃eration Kit、pOG44质粒、pcDNA5/FRT质粒、F12培养基、牛血清、LipofectAMINE2000、潮霉素B购自Life Technology公司；Taq DNA聚合酶、限制性内切酶购自NEB公司；T4DNA连接酶为Promega公司产品；Gel Extraction Kit、Endo-free Maxiplasmid Ex⁃traction Kit购自 Qiagen公司；Prestained Protein Marker购自博迈德生物有限公司；Human IL-7 ELISA Kit购自Abcam公司；人IL-7单克隆抗体购自R&D公司；流式细胞仪为BD公司产品；FITC标记的山羊抗小鼠IgG、HRP标记的羊抗鼠IgG购自中杉金桥公司。

IL-7基因（GenBank：KJ891458.1）全长531 bp，编码由177个氨基酸残基构成的蛋白，使用linker加上CTP蛋白。按照CHO细胞密码子偏嗜性进行优化，5'和3'端分别添加NheⅠ和NotⅠ酶切位点，由Life Technology公司合成。

1.2 表达载体构建

按试剂盒说明书提取质粒，用NheⅠ和NotⅠ分别酶切pGEM-T easy载体上的IL-7基因片段和pcDNA5/FRT质粒，反应体系50 μL，37℃水浴4 h，1.3%琼脂糖凝胶电泳（100 V，30 min）检测。将IL-7基因片段和pcDNA5/FRT质粒进行胶回收，所得产物用于连接，反应体系10 μL，4℃水浴过夜。将获得的pcDNA5/FRT-IL-7表达质粒转化大肠杆菌DH5α后测序确认，用 Endo-free Maxiplasmid Ex⁃traction Kit大提质粒。

1.3 基因转染和阳性细胞克隆的筛选

接种细胞至24孔细胞培养板，次日细胞约布满85%，加入潮霉素B（终浓度依次为300、400、500、600、700、800、900、1000 μg/mL）进行筛选，培养10～14 d，以最低细胞全部死亡浓度为基准测算潮霉素B杀伤Flp-In-CHO细胞的最小浓度。

将1×106Flp-In-CHO细胞铺于6孔板上，待细胞铺满整孔90%时转染。pcDNA5/FRT-IL-7-CTP和辅助质粒pOG44按1∶9的摩尔比混合，将4 μg质粒和 5 μL Lipo2000 分别稀释于 250 μL optim-MEM培养基中，混合后，加入一孔用optim-MEM培养基洗涤过的CHO细胞中，共同孵育5 h后换成含10%胎牛血清的F12培养基，24 h后转入小瓶，用700 μg/mL潮霉素B加压筛选，2～3周后获得阳性克隆，将该阳性克隆细胞稀释至约100/20 mL培养基后接种于96孔板，而后逐渐将单个细胞形成的克隆转至24孔板和6孔板放大培养，收集上清。

1.4 间接免疫荧光法检测细胞表达的目的蛋白

将转染24 h后的细胞或单克隆细胞转移至一个新的24孔板，次日于4℃培养30 min后弃去培养液，用PBS洗细胞3次，每孔加入800 μL预冷的甲醇，-20℃固定细胞20 min，弃去甲醛液，用PBS洗细胞3次，每孔加入1∶1000稀释的小鼠抗人IL-7单克隆抗体，37℃孵育1 h，弃去一抗，用PBS洗细胞4次，再加入1∶5000稀释的FITC标记的羊抗小鼠IgG，37℃孵育1 h，最后用PBS洗细胞4次，荧光显微镜下观察结果。

1.5 细胞染色体上整合的目的基因检测和细胞稳定性鉴定

按照核酸提取试剂盒说明书提取单克隆细胞核酸，使用特异性引物扩增。反应体积为25 μL，包括50 pmol/μL 引物各 1 μL、5×反应缓冲液 5 μL、dNTP 1 μL、Ex Taq DNA聚合酶0.25 μL。反应条件：94℃变性 5 min；94℃ 30 s，52℃30 s，72℃ 35 s，30个循环。扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳分离后进行观察。将单克隆细胞传至5代和8代后提取核酸，用上述PCR方法检测，验证该插入片段是否依然存在。

1.6 Western印迹检测IL-7的表达

将筛选获得的单克隆细胞株扩大培养，收集5×106细胞煮沸，收集1.5 L细胞培养液上清，平均分成4份，分别进行40%、50%、70%和80%硫酸铵饱和度沉淀，10 000 r/min离心30 min，收集4份沉淀，均将其用20 nmol/L PB和0.5 mol/L NaCl稀释，并在该液体中透析后超滤浓缩，煮沸后进行12%的SDSPAGE。采用半干电转法将凝胶上的蛋白转移至硝酸纤维素膜上，再将膜置于5%脱脂奶粉中，于4℃振荡过夜；次日，依次加入小鼠抗IL-7单抗和HRP标记的羊抗小鼠IgG，洗膜后，应用TBM显色。

1.7 IL-7表达水平检测

取单克隆细胞24 h培养液稀释至1/1000备用。将试剂盒中的标准品按1/3的梯度稀释，用IL-7 ELISA试剂盒进行检测，加入终止液后，在酶标仪上读取D450nm值。

1.8 IL-7促外周血单核细胞增殖活性

抽取20 mL人静脉血，用达科为公司外周血淋巴分离液试剂盒分离外周血单核细胞，用含10%FBS、10 mg/mL PHA-P的 1640培养液培养 5 d，PBS洗涤细胞，0.1%FBS/PBS重悬细胞，并将细胞分为7管，每管1×106细胞（约250 μL）；用DMSO将5 mmol/L的CFSE稀释至5 μmol/L后每管加入500 μL，37℃孵育10 min，用冰冷的FBS立即终止标记10 min；离心洗涤2次，用含10%FBS的1640培养液重悬细胞，向b～f管分别加入IL-7；用正常Flp-In-CHO细胞培养24 h的上清稀释R&D公司的IL-7作为对照，IL-7浓度分别为1、5和10 ng/mL，标记为b、c、d管。上述ELISA定量的单克隆细胞上清，IL-7的终浓度也为1、5和10 ng/mL，标记为e、f、g管。a管为PHA-P刺激，不加IL-7的阴性对照。IL-7刺激72 h后上机检测。

2 结果

2.1 重组表达质粒鉴定

PCR产物和酶切产物的琼脂糖凝胶电泳分析表明片段大小符合预期。以BGH和CMV为引物测定表达载体上的目的片段，未见突变位点。PCR电泳图与稳定转染细胞PCR鉴定电泳图相似。见图1。

2.2 潮霉素B筛选阳性细胞及单克隆化

用700 μg/mL潮霉素B筛选，约14 d后，经96孔板单克隆化，鉴定获得2株IL-7表达量较高的单克隆细胞株，分别命名为CHO-IL-7-C3和CHO-IL-7-D7。

2.3 单克隆细胞中整合的目的基因检测和稳定性检测

收集单克隆细胞，反复冻融3次后，用QIAGEN公司核酸提取试剂盒提取核酸，以CMV和BGH为引物进行PCR扩增（图1）。细胞传5～8代后，仍能在该细胞上检测到目的基因（此部分电泳图略）。

2.4 Western印迹检测上清和细胞内的目的蛋白

由于表达的是分泌蛋白，所以细胞内IL-7含量较低，但通过Western印迹可以检测到目的蛋白。细胞培养上清经硫酸铵沉淀浓缩后，可见目的蛋白主要集中在用40%～80%饱和硫酸铵沉淀中。见图2。

2.5 IL-7表达水平测定

通过ELISA标准曲线测定，按照该试剂盒说明书计算，所筛选到的2株细胞的IL-7表达量为3～4 mg/L（具体数据略）。

2.6 IL-7-CTP蛋白促外周血单核细胞增殖活性

用CSFE标记的外周血单核细胞经不同浓度的CHO表达的IL-7和R&D公司的IL-7处理后，P3代细胞增殖情况见图3，可见用CHO表达的IL-7的促外周血增殖能力明显强于R&D公司的对照产品。

3 讨论

病毒必须在细胞内才能繁殖，在抗病毒的同时加上免疫治疗具有很好的应用前景，近年来在HIV多靶点治疗方面取得了突破性进展，其中最重要的经验是抗病毒治疗与免疫治疗的多靶向联合治疗，如IL-7和HIV疫苗抗病毒药物联合使用等[8]。IL-7是一种多能性的免疫调节剂，目前国际上正在进行的相关临床试验就有20项，主要针对癌症，如乳腺癌、结肠癌、膀胱癌等[9-10]。所以，开展IL-7的表达、生物活性和功能的相关研究是非常必要的。

定点表达系统避开了随机整合在非热点区而导致表达量较低的缺陷，易于筛选，但要筛选到很高表达量的细胞株也非常困难。本实验中，我们通过ELISA、PCR、Western印迹等方法，在细胞转染、筛选、稳定传代等多阶段均证明了IL-7的表达，并进行了定量。由于表达的IL-7是分泌蛋白，所以细胞内的蛋白量较低，Western印迹检测显示条带较弱。而经过硫酸铵沉淀后，蛋白量得以富集，并且主要存在于40%～80%饱和硫酸铵溶液沉淀中，对下一步纯化实验较为有利。但还须进一步筛选表达量更高的细胞株，为后续研究甚至生产奠定好的基础。

图1 重组质粒pcDNA5/FRT-IL-7的PCR（A）和酶切（B）鉴定

图2 IL-7-CTP经40%～90%硫酸铵沉淀（A）和单克隆细胞（B）的Western印迹M：蛋白marker；1：单克隆细胞CHO-IL-7-C3；2：单克隆细胞CHO-IL-7-D7；3：未转染的CHO细胞

促外周血单核细胞增殖试验结果表明，本研究获得的IL-7在各浓度梯度均可促进外周血单核细胞增殖，且作用优于R&D公司的IL-7。可能是因为我们采用CHO细胞表达体系，而对照品为原核系统表达。IL-7含有4个N糖基化和1个O糖基化位点，3个二硫键，原核系统表达时不能形成正确的糖基链，而在CHO细胞中经过修饰后，可以形成正确的糖基化及空间结构[11]，因此其功能要强于R&D公司的产品。

图3 CHO培养上清和R&D公司的IL-7促外周血单核细胞增殖活性a：仅用PHA刺激；b、c、d：分别为1、5和10 ng/mL R&D公司的IL-7刺激；e、f、g：分别为1、5和10 ng/mL CHO培养上清的IL-7刺激

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