邓卓峰，周 峥

牙周牙髓联合病变是牙周病或根尖周病晚期发生的导致广泛牙周组织破坏及牙髓病变综合征［1-4］，其与口腔中的微生物共同作用是导致失牙的重要原因［5］。随着分子生物学技术的不断发展，PCR-DGGE等检测微生物菌群方法的应用促进了口腔生物学的进步，牙周牙髓联合病变依据病变来源分为牙周源性、牙髓源性和二者联合作用导致的牙髓病变［6］。本文着重分析牙周源性牙周牙髓联合病变的微生物感染种类，为临床针对性治疗提供依据。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择2013年1—12月收治的牙周牙髓联合病变38例，其中男21例，女17例;年龄23～38(25.26±2.92)岁。所有患者进行了病史、临床口腔专科检查和影像学检查。38例选取78颗患牙，患牙均因存在炎症致Ⅱ～Ⅲ度松动，其牙周袋深度≥5 mm［7］，且至少存在1个牙位牙周袋探诊深度至根尖，且均无龋、无隐裂等牙体疾病，3个月内未使用过抗生素。同时选取同期38例来我院进行正畸的78颗同样牙位的拔除牙作为对照样本，男20例，女18例;年龄22～40(26.12±2.88)岁。患者无其他口腔疾病，均知情同意，排除龋齿、非龋性疾病、隐裂，3个月内使用过抗生素者。两组年龄、性别等一般资料差异无统计学意义(P＞0.05)，具有可比性。

1.2 标本采样方法

1.2.1 牙周袋标本:两组均采集牙周袋标本，在操作前以无菌刮匙清除龈上菌斑，防止龈上菌斑干扰，之后以生理盐水漱口1 min，取样牙采用棉卷隔离隔湿，探诊患牙牙周袋至根尖的牙根牙周组织，隔湿吹干，以吸潮纸纸尖蘸取牙周袋牙冠2/3的龈沟液，之后迅速放入牙周袋底部，约20～30 s后取出，以无菌剪刀剪下其尖端5 mm放入含有PBS液的离心管;同时以无菌刮治器探入牙周袋底部刮取牙根的菌斑于灭菌的PBS液中。2种操作均重复1次，均于-20℃保存作为牙周袋标本。

1.2.2 根管采样:在患牙拔出后，在根尖1/3处截断，如无成形牙髓时，采用蘸有无菌生理盐水的无菌锉反复锉根尖1/3处的根管后壁，之后将无菌吸潮纸插入，停留20～30 s取出，以无菌剪刀剪下其尖端5 mm作为根管标本。

1.3 标本检测方法 将存于-20℃的样本解冻，8000 r/min离心3 min，去上清后加入90μl缓冲液(主要为溶菌酶)37℃处理30 min，采用天根生化科技(北京)有限公司的细菌基因组DNA提取试剂盒提取2种标本DNA，并以其为模板，之后进行PCR扩增，采用细菌通用引物［8］，上游引物为968f-GC(5＇-CGCCCGGGGCGCGCCCCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGAACGCGAAGAACCTTAC-3＇)，下游为 1401r(5＇-CGGTGTGTACAAGACCC-3 ＇)，生 成 全 长 为 16S r DNA的V2-V3区［8-9］。模板DNA加热至93℃ 4 min后，使其双链或经PCR扩增形成双链DNA解离成单链，以为其与引物结合进行下轮反应循环;之后，温度降至55℃，引物与模板DNA单链互补序列配对结合，形成DNA模板-引物结合物，其在 Taq DNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成新的与模板DNA链互补的半保留复制链，重复循环变性-退火-延伸过程，在其过程中根据不同的PCR引物序列，设置不同的退火温度和时长［10］(第一步:93℃变性 4 min、55℃退火 40 s、70℃延伸 1.5 min;第二步:93℃1 min、56℃30 s、72℃30 s;72℃优化7 min)。PCR反应体系为50μl(北京全式金生物科技公司)，以1.5%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。每个样本取35μl，变性剂凝胶的浓度采用40% ～60%的6%聚丙烯酰胺凝胶，进行100%变性，之后采用1∶10 000的 SYBR GreenⅠ核酸燃料染色40 min，将染色的凝胶采用ImageLab成像系统分析拍照，观察标本的电泳条带，并将有代表性的条带进行切胶至灭菌的蒸馏水中(4℃ 24 h)后，离心取上清为模板进行PCR循环，之后将反应产物进行克隆测序并使用GenBank的BLAST对测序结果进行序列分析和序列同源性比较［8，11］。

1.4 统计学方法 采用SPSS 17.0统计软件进行分析，计量资料以均数±标准差(x±s)表示，采用t检验;计数资料以率(%)表示，采用χ2检验;相关因素分析采用Spearman相关性分析，α=0.05为检验水准。

2 结果

2.1 微生物检出情况 观察组48颗患牙标本检出微生物，检出率为61.54%。48颗患牙牙周袋均检出微生物，检出率为100%;29颗患牙根管牙髓检出微生物，检出率为60.42%。牙周袋微生物检出率高于根管(χ2=9.128，P＜0.05)。对照组12颗检出微生物，检出率为15.38%，均为牙周袋检出。观察组患牙微生物检出率高于对照组(χ2=14.927，P ＜0.05)。

2.2 菌属情况 观察组BLAST测序结果显示，患牙标本中牙周袋菌属为变形菌门的弯曲菌属34颗、放线菌属42颗、梭杆菌门的梭杆菌属28颗、肠杆菌门的肠杆菌属19颗和变形菌门的嗜血杆菌属14颗;根管标本菌属为放线菌门的棒状杆菌属25颗和放线菌属4颗。对照组拔除牙齿中牙周袋菌属为奈瑟菌属8颗、放线菌属6颗和弯曲菌属3颗。两组同一标本具有多重微生物感染。

2.3 菌种条带 对观察组牙周袋、根管牙髓标本和对照组标本菌种条带做PCA发现，观察组中牙周袋标本菌种条带14.33%～57.85%在同颗牙根管牙髓标本中存在，但根管牙髓标本中菌种条带有1.32%～67.55%在同颗牙牙周袋标本中不存在。观察组中菌种条带1.21%～4.38%在对照组同位牙标本中存在，但对照组标本中菌种条带有0～0.57%在观察组同位牙标本中不存在。

2.4 菌种与牙周源性牙周牙髓联合病变相关性分析 将观察组和对照组的棒状杆菌属、放线菌属、弯曲菌属、梭杆菌属和嗜血杆菌属进行赋值(阳性=1，阴性 =0)，以牙周源性牙周牙髓联合病变(阳性=1，阴性=0)为应变量Y，以上因素为自变量X进行回归分析显示，牙周源性牙周牙髓联合病变与弯曲菌属、放线菌属、梭杆菌属、肠杆菌属、嗜血杆菌属感染呈正相关(r=0.232，P＜0.05)。

3 讨论

牙髓和牙周组织解剖学结构互通，因此当发生牙周牙髓联合病变时，二者微生物感染种类常交叉感染，致难区分牙周牙髓联合病变的来源是牙周源性还是牙髓源性，或者是二者联合作用。国内外文献对可能引起牙周牙髓联合病变微生物种类的系统研究较少，而着重单独研究牙周源性导致的牙周牙髓联合病变的报道更少［6-10］。为了增加此方面的临床观察数据，本研究采用了PCR-DGGE生物技术检测了牙周牙髓联合病变患牙中牙周袋和根管内微生物情况，初步探讨了牙周源性牙周牙髓联合病变的微生物种类。

传统研究中将口腔微生物测定以细菌培养法为主，其认为限定了菌种的范围［11-12］，难以全面分析口腔微生物菌种情况，因此本文采用了PCR-DGGE法，其通过分析细菌菌落的基因多态性可直观识别菌种而不受培养条件限制，其敏感度和特异度相对均较高［13］，因此可全面分析微生物的种类。本研究结果发现牙周牙髓联合病变的牙周袋微生物检出率为100%，高于根管牙髓微生物检出率的60.42%，对照组牙周袋微生物检出率为100%，说明牙周源性牙周牙髓联合病变与微生物感染相关。对其感染的菌种条带分析发现，观察组中牙周袋标本菌种条带14.33%～57.85%在同颗牙根管的牙髓标本中存在，但根管牙髓标本中菌种条带有1.32% ～67.55%在同颗牙牙周袋标本中不存在;观察组中菌种条带1.21%～4.38%在对照组同位牙标本中存在，但对照组标本中菌种条带有0～0.57%在观察组同位牙标本中不存在，说明牙周源性牙周牙髓联合病变患牙牙周组织和牙髓组织中的菌群结构和组成具有相似性的同时还具有差异性，这可能与患牙局部内环境差异和其中原有微生物的存在相关，即局部微环境自然选择的结果［14］。另外，国内外研究发现，牙周组织的菌群在牙周炎进展到一定程度时可通过根管、根尖等通道进入到牙髓中存活、繁殖，导致牙髓损伤，或影响到根管内牙髓的微环境，从而使牙髓内原有微生物复苏［15-21］。

根据BLAST测序检测微生物种类发现牙周源性牙周牙髓联合病变牙周袋微生物感染以弯曲菌属、放线菌属、梭杆菌属、肠杆菌属、嗜血杆菌属为主;牙髓主要以棒状杆菌属和放线菌属感染为主;而正常人群口腔检出菌属以奈瑟菌属、放线菌属和弯曲菌属为主，这与 Krmek 等［22］、Chaniotis等［23］、万蕾和章锦才［24］的研究结果相似。对菌种与牙周源性牙周牙髓联合病变相关性分析结果显示，牙周源性牙周牙髓联合病变与弯曲菌属、放线菌属、梭杆菌属、肠杆菌属、嗜血杆菌属感染有关。

总之，牙周源性牙周牙髓联合病变发生与微生物感染有关，且牙周源性与牙髓源性感染微生物种类既有相似又有不同，因此临床可针对其微生物感染种类进行辅助治疗［25-28］，以提高治愈率。

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