王建芳

（张家口市第四医院检验科，河北 张家口 075000）

角膜溃疡病原体筛选及耐药性分析

王建芳

（张家口市第四医院检验科，河北 张家口 075000）

目的 筛选角膜溃疡病原体菌种并分析病原体的耐药性。方法选取2012年10月至2013年9月在我院就诊的角膜溃疡患者123例，取溃疡组织标本，筛选并鉴定菌种，采用滤纸扩散法评价筛选菌种对常用抗生素药物的敏感性。结果筛选到细菌菌种有绿脓杆菌、肺炎链球菌、莫拉－阿克森费尔德二氏杆菌和葡萄球菌；真菌菌种有镰刀菌、曲霉菌和白色念珠菌。白色念球菌阳性者93例，阳性率为75.61%，阳性率最高；肺炎链球菌阳性者12例，阳性率为9.76%，阳性率最低。葡萄球菌和白色念球菌对9种抗生素的耐药率均为60.00%，而肺炎链球菌和绿脓杆菌对3种抗生素的耐药率均为20.00%，差异均有统计学意义(P＜0.05)。结论角膜溃疡病原体主要以细菌和真菌为主，且真菌的耐药性较强。

角膜溃疡；病原体；耐药性；葡萄球菌

角膜溃疡患者会有眼球周围积脓，表现为白色、黄白色或灰白色溃疡，随着疾病进展病情更加严重。溃疡严重会直接影响患者视力，严重者会有眼部水肿[1]。目前治疗方案以抗生素治疗为主，主要是用于杀死角膜溃疡的病原体(细菌和真菌)[2]，但大量的抗生素使用会引发病原体的耐药性，从而造成抗生素无法发挥治疗效果。有关病原体的耐药性临床上经常出现，且呈现逐渐升高的趋势[3]。本文首先筛选了角膜溃疡病原体细菌和真菌，并研究病原体的耐药性，现报道如下：

1 资料与方法

1.1 材料 选取2012年10月至2013年9月在我院就诊的角膜溃疡患者123例，用无菌镊子取每位患者眼角膜溃疡处溃疡组织，在无菌条件下放入盛有10 ml已灭菌的无菌水锥形瓶中，盖上纱布，系紧瓶口，锥形瓶中有玻璃珠。震荡锥形瓶，使溃疡组织充分与无菌水混匀，用于菌种筛选。

1.2 菌种筛选 将混匀的悬液进行10倍稀释，一直稀释下去，将103、104、105、106、107、108、109和1010倍稀释的菌液取0.5 ml，在超净台无菌条件下吸入细菌固体培养基和真菌PDA固体培养基中，分别用涂布棒涂平，然后细菌培养基培养皿放入37℃培养箱中培养12～18 h，真菌PDA固体培养基放入28℃培养箱中培养20 h以上。挑取单菌落的培养皿，进行单菌落分析以及1.4的菌种鉴定程序。

1.3 菌种鉴定 首先取细菌培养基上生长的菌落特征不同的菌落涂片进行革兰氏染色，鉴定细菌的革兰氏特征。根据葡萄球菌、链球菌、肠球菌杆菌菌落特征进行鉴定并统计，计算123例患者中各种细菌病原体阳性率。挑取PDA培养基上单菌落的真菌进行鉴定，通过水片在较暗的视野下观看，G染色为G+，菌体较大，通过芽管实验鉴定出Cal，该菌占真菌分离的80%以上，可通过印度墨汁染色可以初步判断为新隐球菌，其他真菌可通过生化实验鉴定到种。最后根据文献[4]描述方法进行分子生物学鉴定，最终确定病灶处菌种种类。

1.4 耐药性分析 将浸有药物的滤纸圆片贴在琼脂培养基上，药物慢慢向四周扩散。如果药物能抑制微生物的生长，则药物扩散之处微生物便不会生长，形成圆形的不生长微生物菌落的圈。药敏纸片均为英国Oxoid公司产品，包括一定浓度的氨苄西林、头孢噻肟、头孢哌酮、哌拉西林/他唑巴坦、头孢哌酮/舒巴坦、头孢西丁、头孢他啶、头孢吡肟、环丙沙星、哌拉西林、亚胺培南、磺胺甲恶唑、庆大霉素、阿米卡星和碳青霉烯类。对药物的敏感性分为三级：敏感、中等敏感、耐药。三个等级相对于大肠埃希菌的抑菌圈直径作比较得出，敏感：对抗生素的抑菌圈直径与大肠埃希菌的抑菌圈直径无显著性差异；中等敏感：对抗生素的抑菌圈直径是大肠埃希菌的抑菌圈直径的50%及以上，且具有显著性差异；耐药：鲍曼不动杆菌对抗生素的抑菌圈直径是大肠埃希菌的抑菌圈直径的50%以下，具有显著性差异。分别统计分离的不同菌种对以上各类抗生素的敏感性及耐药的抗生素种类数量和比例。

1.5 统计学方法 应用SPSS18.0软件进行统计学分析，所有计数资料比较均采用χ2检验，以P＜0.05时表示差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 角膜溃疡病原体筛选结果 筛选到细菌菌种有绿脓杆菌、肺炎链球菌、莫拉-阿克森费尔德二氏杆菌和葡萄球菌；真菌菌种有镰刀菌、曲霉菌和白色念珠菌。其中绿脓杆菌阳性者61例(49.59%)、肺炎链球菌阳性者12例(9.76%)、莫拉-阿克森费尔德二氏杆菌阳性者45例(36.59%)、葡萄球菌阳性者35例(28.46%)、镰刀菌阳性者73例(59.35%)、曲霉菌阳性者23例(18.70%)、白色念珠菌阳性者93例(75.61%)。

2.2 病原体耐药性分析 将每种筛选的菌种对待测抗生素的敏感、中等敏感和耐药情况进行统计分析显示，葡萄球菌和白色念球菌对9种抗生素的耐药率均为60.00%，显著高于肺炎链球菌和绿脓杆菌耐药率(均为20.00%)，差异均有统计学意义(P＜0.05)，见表1。

表1 病原体对15种抗生素的耐药性分析[例（%）]

3 讨论

角膜溃疡是由于眼球因暴露空气接触细菌造成角膜被细菌、病毒或真菌感染，引起角膜处感染溃疡，主要是由于异物损伤、剔除异物损伤、沙眼及其他原因造成的感染[5]。此外，维生素A缺乏、面瘫、眼睑闭合阻碍等也会引起角膜溃疡[6]。在发病初期，症状表现为怕光、易流泪、眼痛、角膜处出现白色小点或片状浸润，严重时症状明显，睁不开眼、视力减退、眼痛难忍等[7]，可见明显灰白色组织坏死的溃疡性脱落，并且伴发紫红色充血。严重时会出现溃疡向四周扩散蔓延、角膜穿孔等症状。可见，角膜溃疡对人体的伤害很大，需要深入了解并且采取合适的预防和治疗方法。引起角膜溃疡的病原体主要有细菌和真菌两大类，不同类型病原体造成的危害不同，认识和了解病原体有助于合理使用抗生素，达到快速较好的治疗效果[8]。同时，抗生素耐药性一直是抗生素临床治疗的瓶颈问题，角膜溃疡病原体抗生素使用也不例外，因此了解病原体的耐药性对于合理使用抗生素有很大的帮助作用。

有关角膜溃疡病原体筛选和药物敏感性报道很多，主要发现曲霉菌[9]、金黄色葡萄球菌[10]、绿脓杆菌[10]、茄病镰刀菌[11]、白色念珠菌、肺炎链球菌、莫拉-阿克森费尔德二氏杆菌[12]等。本文筛选到的细菌菌种有绿脓杆菌、肺炎链球菌、莫拉-阿克森费尔德二氏杆菌和葡萄球菌；真菌菌种有镰刀菌、曲霉菌和白色念珠菌，跟上述报道一致。王建芳[13]通过刮片收集了166例化脓性角膜溃疡病例溃疡标本，筛选到的病原体55.45%为细菌，19.3%为真菌。赵恳等[14]通过药敏试验分析了筛选的病原体敏感性特征，结果得出细菌对药物敏感，真菌较不敏感。耐药性问题一直是抗生素临床使用顾忌的问题，因此本文重点对本院接收的角膜溃疡患者病灶中病原体进行分离，并且鉴定病原体种类并分析每种病原菌对常见抗生素的耐药情况。结果显示，葡萄球菌和白色念球菌对9种抗生素耐药，耐药率均为60.00%，而肺炎链球菌和绿脓杆菌仅对3种抗生素耐药，耐药率均为20.00%，说明真菌的耐药性较细菌高，此结果对指导角膜溃疡抗生素用药具有重要参考价值。

虽然本文明确了角膜溃疡病原体种类以及耐药性特征，但仅具有参考性价值。限于病例数量、区域差异以及医院差异等因素，会出现结果不一致的情况，但值得肯定的是，角膜溃疡患者病灶处的病原体有绿脓杆菌、肺炎链球菌、莫拉-阿克森费尔德二氏杆菌和葡萄球菌、镰刀菌、曲霉菌和白色念珠菌，并且存在耐药性。

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R772.21

B

1003—6350（2015）03—0448—02

10.3969/j.issn.1003-6350.2015.03.0162

2014-08-05)

王建芳。E-mail：2924073595@qq.com