彭涛，李曙光

(1河北北方学院，河北张家口075000;2河北北方学院附属第一医院)

DNA甲基化是指生物体在DNA甲基化酶的作用下，以S-腺苷甲硫氨酸为甲基供体，将甲基转移到特定碱基上的过程。不同类型的肿瘤都有其特定的DNA甲基化模式，在不同肿瘤或同一肿瘤的不同发生、发展阶段，基于基因组DNA上CpG岛甲基化状态的差异，构成了肿瘤特定的DNA甲基化谱。应用DNA甲基化芯片研究胃癌DNA甲基化情况，可从表观遗传学角度明确DNA甲基化在胃癌形成过程中的作用，进一步明确胃癌形成的分子机制，为胃癌的早期诊断、治疗及预后提供理论依据。

1 DNA甲基化与肿瘤的关系

研究发现，除了基因突变之外，表观遗传改变也与肿瘤的发生、发展密切相关。表观遗传学是指DNA序列不发生变化，但基因表达发生可遗传的改变，这种改变在细胞生长发育与增殖过程中能继续传递［1］;表观遗传修饰的改变会使基因表达发生异常，导致疾病的发生。DNA甲基化是哺乳动物基因组中最为常见的表观遗传学事件之一。正常的DNA甲基化可维持机体的正常功能，如基因组结构的稳定、胚胎正常发育以及细胞分化等［2，3］;而异常的DNA甲基化则会导致肿瘤的发生［4］。CpG岛是基因启动子区的一段长约0.5～2 kb的CpG富集区，人类基因组中已发现大约有27 800个CpG岛，约60%的基因在5’端有CpG岛［5］。CpG岛在正常情况下是不甲基化的，并由各种转录因子控制基因的表达。异常甲基化包括高甲基化和低甲化，前者指正常组织中未甲基化的位点被甲基化，后者是指在正常组织中发生甲基化的位点去甲基化。DNA甲基化模式的改变常常出现在肿瘤发生、发展的早期，并且可在同一肿瘤中同时发生。启动子区CpG岛高甲基化通过使抗细胞增殖基因、凋亡基因、抗血管生成基因、DNA修复基因和抗转移基因等的转录沉寂与肿瘤的形成具有相关性［6］。基因组低甲基化水平不但可以激活原来保持沉默状态的基因(尤其是原癌基因)的表达，而且还可引起染色质改变，进而导致遗传不稳定性增加;而抑癌基因启动子区(CpG岛区)局部过度甲基化导致基因转录沉默。在肿瘤组织中，DNA甲基化水平的改变导致原癌基因的激活或抑癌基因的失活。全基因组水平DNA低甲基化使沉默的原癌基因激活，而高甲基化使DNA转录抑制，导致抑癌基因、DNA错配修复基因、细胞周期调控基因低表达或不表达，从而引起肿瘤的发生［7～9］。不同类型的肿瘤中，检测到发生甲基化的基因及甲基化的程度也不相同。如Wilhelm等［10］发现LINE1的低甲基化与膀胱癌的发生密切相关。Uhm等［11］报道胆管癌的发生与肿瘤抑制因子CpG岛启动子甲基化异常有关。

2 DNA甲基化与胃癌的关系

2.1 DNA高甲基化与胃癌 DNA高甲基化是指在最初未甲基化位点的甲基化增益，通常会导致稳定的转录沉默，调节基因的表达。常见DNA高甲基化为转录因子4(TCF4)启动子甲基化。使用甲基化特异性聚合酶链反应(MSP)和焦磷酸测序(PS)方法对120例胃癌组织和40例正常胃黏膜组织中的TCF4启动子甲基化程度实施评估，结果显示，TCF4的甲基化频率在进展期胃癌与早期胃癌、胃癌与正常胃黏膜之间均存在统计学差异。通过PS显示TCF4甲基化状态与肿瘤大小、Lauren分型、浸润深度、淋巴结转移、肿瘤淋巴结转移阶段有显著相关性［12］。

2.2 DNA低甲基化与胃癌 DNA低甲基化是在人类肿瘤中识别的最初的表观遗传异常。最新的高分辨率全基因组研究证实，DNA低甲基化与基因组高甲基化相伴行，只是通常发生在不同的序列。越来越多的证据表明，癌基因低甲基化可导致基因再次激活。Shin等［13］报道，胃癌组织中MOS基因启动子甲基化与肿瘤浸润深度、淋巴结转移以及弥漫型具有相关性。通常正常组织中 c-myc基因3’端CCGG是被甲基化的，低甲基化导致该基因高表达，引起肿瘤的发生。Sharrard等研究也证实，该基因在40%～50%的胃癌组织中甲基化水平降低。提示低甲基化是胃黏膜细胞发生癌变的重要遗传学事件之一。

2.3 DNA甲基化与胃癌的早期诊断 DNA甲基化检测有助于胃癌的早期诊断。Bernal等［14］采集了32例胃癌患者的肿瘤组织标本，采用甲基化特异性PCR方法对24个基因进行了甲基化分析，其中一半以上患者的11个基因出现了高度甲基化，8个基因与胃印戒细胞癌在统计学上具有相关性;通过和无症状的对照组相比较，筛选出Reprimo为胃癌早期检测的潜在生物标记物。p16基因(CDKN2a/INK4a)是一个重要的抑癌基因，除了基因缺失和点突变的p16基因，p16基因失活与启动子甲基化有关［15］。Abbaszadegan 等［16］研究表明，在胃癌早期，p16启动子发生高甲基化，并且与胃癌恶性程度具有相关性，其可作为胃癌早期检测的标志物。在血清标本中，利用甲基化特异性酶链反应对候选基因的启动子区的甲基化进行测试，包括胃癌组58例，癌前病变46例，正常对照组30例。通过分析，获得了82个甲基化的基因，其中5个基因(BCAS4，CHRM2，FAM5C，PRAC，MYLK)被定为候选基因。从正常组织→癌前病变→胃癌，3个基因(CHRM2，FAM5C，MYLK)被进一步确认显示甲基化率升高。从术前到术后评估，除了CHRM2、MYLK和FAM5甲基化程度明显降低，FAM5C和MYLK甲基化联合检测与单一基因检测相比较，在胃癌诊断和预警方面具有较高的敏感度和特异性。FAM5C与 MYLK联合下的甲基化状态与肿瘤大小、肿瘤浸润深度、肿瘤淋巴结转移以及TNM分期具有相关性。因此，高甲基化FAM5C和MYLK可以作为潜在的早期诊断和预警的生物标记。

2.4 DNA甲基化与胃癌预后和治疗的关系 DNA甲基化可作为胃癌预后判断的重要指标。Sugita等［17］对80例使用氟尿嘧啶类药物治疗的胃癌转移或复发患者与无甲基化患者进行比较，BNIP及DAPK基因甲基化患者的无瘤生存时间及总体生存时间较短，且甲基化患者的化疗敏感性相对较差。Park等［18］发现，基因组中甲基化程度较高的胃癌患者预后较差。Sakakuar等［19］采用 RTQMSP法对胃癌患者外周血RUNX3的甲基化情况进行检测，发现RUNX3甲基化的患者较正常组预后较差。由于表观遗传修饰具有可逆性，因此可利用这一特性预防和治疗癌症。DNA甲基化是通过DNA甲基化转移酶发挥作用，去甲基化药物主要是指DNA甲基化转移酶抑制剂，如5-氮胞苷和5-氮-2-脱氧胞苷。其主要通过共价键与DNA甲基化转移酶结合，形成不可逆的复合物，从而使基因组甲基化水平降低，使高甲基化的抑癌基因重新发挥作用。5-氮-2-脱氧胞苷对骨髓增生异常综合征的治疗作用，使其成为第一个被美国FDA批准上市治疗恶性肿瘤的去甲基化药物，通过对41例白血病患者应用该药物后显示，大多数患者临床症状较前明显减轻［20，21］。在乳腺癌、膀胱癌等体外培养的肿瘤细胞株中，5-氮-2-脱氧胞苷可逆转多种基因(如 APC、p15、Rb、p16、E-cadherin等)启动子的甲基化状态，对肿瘤发挥作用。在胃癌组织中，5-氮-2-脱氧胞苷可逆转多种基因的甲基化状态，如 hMLH1、RASSF1A和 P16基因等［22］。

2.5 胃癌DNA甲基化的检测 胃癌相关基因启动子的异常甲基化是肿瘤发生的重要敏感性生物指标。目前许多方法被用于测定CpG岛甲基化状态，如限制性内切酶PCR、重亚硫酸盐基因组DNA测序、甲基化特异性 PCR(MSP)、Southern印迹杂交等。甲基化限制性内切酶法是经典的甲基化情况分析法，主要根据一些限制性内切酶不能切开甲基化的DNA序列的原理［23］。内切酶包括HpaⅡ和MspⅠ，这对酶可识别CCGG位点，鉴于两种酶对甲基化敏感程度不同，二者分别为鉴别甲基化序列和识别CCGG位点。这种方法既简便又便宜。其缺点是:由于非该序列中的CG容易被忽略，因此可靠性欠佳。重亚硫酸盐基因组DNA测序是通过重亚硫酸钠使非甲基化的C经过脱氨基转化成U，而DNA甲基化的C不发生变化，经过PCR扩增，所有的U转化为T，而甲基化胞嘧啶残基仍为胞嘧啶形式。PCR扩增产物经过测序并且单个CpG位点的甲基化状态通过和给定启动子的非修饰序列进行比对分析。通过对高甲基化的启动子CpG位点的定位，明确其在调控肿瘤相关基因转录中的重要作用。以亚硫酸氢盐处理为基础的方法是经典的甲基化研究方法，但是费时费力且只能以特定的基因为目标，对于甲基化谱的研究并不适用，因此建立有效可靠的高通量方法用于早期癌诊断的甲基化检测具有重要意义［24］。Zheng 等［25］利用甲基化芯片确定候选基因后，并利用MSP技术进行组织和血清中的甲基化状态的评价。使用5-aza-dC处理胃癌细胞株，96 h后，通过使用RT-PCR技术对mRNA的表达进行了去甲基化的效果的评价。结果显示，与健康人相比较，在胃癌患者的组织和血清中，观察到BX141696，WT1，CYP26B1，KCNA4等基因具有较高的甲基化。5-aza-dC干预后治疗在胃癌细胞株的mRNA表达这些基因的水平恢复。这项研究强调的潜在应用，筛选候选基因的DNA甲基化芯片技术具有重要的价值。

鉴于目前胃癌DNA甲基化的研究多集中于单个或几个基因，且DNA甲基化在胃癌发生、发展和浸润转移过程中的作用尚不明确。因此，明确DNA甲基化和其表达与胃癌组织学类型、肿瘤的部位、浸润深度、淋巴结和腹膜转移及预后的关系，具有重要意义。建立胃癌DNA甲基化谱，探索胃癌发生、发展的表观遗传性机制，并拟建立胃癌分子分期及判断预后的分子标记物群，并针对靶分子设计干预措施，为胃癌的治疗开辟新的路径。

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