谭小方，金华，丁家怡

(南通市妇幼保健院，江苏南通226006)

·综述与讲座·

体外胚胎培养液代谢组学分析在评价胚胎发育潜能的研究进展

谭小方，金华，丁家怡

(南通市妇幼保健院，江苏南通226006)

代谢组学是对溶液、组织、细胞等生物样本中的小分子代谢物进行定性和定量分析，从而得到生物体受外界刺激后其代谢水平的整体变化的结果。其研究过程包括代谢组数据的采集、预处理、多变量数据分析、标记物识别和途径分析等步骤。代谢组学作为一种新兴技术，在辅助生殖技术中具有很好的应用前景。胚胎的发育和代谢是个动态过程，应用质谱分析、光谱分析和磁共振波谱技术能客观、全面、准确、无创地反映胚胎质量及其发育潜能，可作为胚胎形态学评估的补充，从而提高胚胎种植率，提高单胚胎移植的妊娠率。

辅助生殖技术；胚胎培养液；代谢组学；胚胎发育潜能

应用人类辅助生殖技术(ART)治疗不孕不育时，胚胎质量是影响胚胎种植的关键因素之一。临床中常需要移植多枚胚胎来提高妊娠率，但会引起多胎妊娠率明显提高，增加产科并发症[1]。选择性单胚胎移植可有效降低多胎率，但如何在降低多胎的同时不影响妊娠率，是目前面临的挑战[2]。目前主要根据卵裂球数量、发育速度、碎片、多核、空泡和卵裂球均一性等形态学评估胚胎质量[3]。形态学评估具有直观、简便的特点，便于迅速选择胚胎，但仍缺乏足够的准确性并有一定的主观性，不能真实反映胚胎的质量及其发育潜能[4]。近年研究表明，体外胚胎养液代谢成分分析结合胚胎形态学评估可更有效地选择有发育潜能的优质胚胎。现将近期研究结果综述如下。

1 代谢组学简介

代谢组学是研究生物整体、系统、器官或细胞的内源性代谢物质及内在或外在因素相互作用的科学[5]。其研究目标是对溶液、组织、细胞等生物样本中相对分子质量为1 000以下的小分子代谢物进行定性和定量的分析，从而得到生物体受外界刺激后其代谢水平的整体变化的结果[6]。在基因—蛋白—代谢终产物这样一个生物信息传递链中，机体需要通过不断调整复杂的代谢网络来维持自身与外界的互动平衡。代谢物作为细胞调控的最终产物，能反映细胞活力，直接体现生物体系生理和生化功能状态。

根据研究对象和目的不同，代谢组学分为4个层次：①代谢物靶标分析：对某个或某几个特定组分的分析；②代谢谱分析：对一系列预先设定的目标代谢物进行定量分析；③代谢组学：对某一生物或细胞所有代谢物进行定性和定量分析；④代谢指纹分析：对代谢物整体进行高通量的定性分析。与转录组学和蛋白组学比较，代谢组学有以下优点：①基因和蛋白的微小变化会在代谢物上得到放大，从而使检测更容易；②不需建立全基因组测序及大量表达序列标签(EST)的数据库；③代谢物的种类要远小于基因和蛋白的数目；④研究中采用的技术更通用，这是因为给定的代谢物在每个组织中都是一样的缘故。

2 代谢组学分析技术

代谢组学的研究过程包括代谢组数据的采集、预处理、多变量数据分析、标记物识别和途径分析等步骤[7]。首先采集生物样品(血液、细胞、组织及培养液等)进行生物反应灭活、预处理，然后再运用质谱法(MS)、气相色谱法(GC)或核磁共振等检测样品中所有代谢物的种类、含量和状态，从而得到大量原始的反映生物样品星系的实验数据，然后使用多变量数据分析方法对获得的多维复杂数据进行降维和信息挖掘，从这些信息中筛选出最能反映代谢物变化的主要成分，再根据代谢物谱在时程上的变化来寻找生物标记物，进而阐述生物体相应的代谢机制。代谢组学目前研究的主要技术平台是MS和磁共振技术[8]，主要包括电喷雾电离质谱(ESI-MS)、液相色谱—紫外光谱—质谱联用(LC-UV-MS)、串联质谱(tandem MS)、液相色谱—质谱联用(LC-MC)以及核磁共振波谱技术(NMR)。由于代谢组学分析对象的大小、数量、官能团、挥发性、带电性、极性以及其他物理化学性质差异很大，要对它们进行无偏向的全面分析，单一分析手段往往难以胜任。GC以其高分离度、高通量，MS以其普适性、高灵敏度和特异性、NMR技术特别是1H-NMR以其对含氢代谢产物的普适性而成为最主要的分析工具。由于LC-MS和气相色谱—质谱联用(GC-MS)能分析范围很广的代谢组分，因此也是代谢组学研究分析中的重要工具。

2.1 NMR NMR是有机结构测定的四大谱学之一，利用生物体液的核磁共振波谱提供的生物体内全部小分子代谢物的丰富信息，通过对这些信息的多元统计分析和模式识别处理，了解相关生物体在功能基因组学、病理生理学等方面的状况和变化，从分子水平来认识其变化规律。NMR的优势在于能够对样品实现无创性、无偏向的检测，具有良好的客观性和重现性，样品处理简单，具有较高的通量和较低的单位样品检测成本。1H-NMR对含氢化合物均有响应，能完成样品中大多数化合物的检测，满足代谢组学中的对尽可能多的化合物进行检测的目标[7]。

2.2 MS MS是一种将分子电离成不同的带电离子，然后按质荷比将其分离、检测，进而推断分子结构的方法。它可以检测微摩尔浓度的代谢产物，也可以进行定量分析，且可以通过分子量来推测代谢产物和进行结构鉴定[8]。目前常用的质谱联用技术有GC-MS、LC-MS、毛细管电泳—质谱联用技术(CE-MS)。GC-MS可以同时测定几百个化学性质不同的化合物，包括有机酸、大多数氨基酸、糖和脂肪酸，具有较高的分辨率和检测灵敏度，但GC不能直接得到体系中大多数难挥发代谢组分的信息，不能分析不稳定物质和一些大分子代谢产物，预处理过程繁琐。相对于GC-MS，LC-MS能分析更高极性和更高相对分子质量的化合物，大多数情况下不需要对非挥发性代谢物进行化学衍生，非常适合于生物样本中复杂代谢产物的检测和潜在标记物的鉴定。CE-MS可提高代谢产物的检测灵敏度和通量，具有高效分离率、微量进样量及快速分析的优势，其最大优点为可在单次分析实验中分离阴离子、阳离子和中性分子，可同时获得不同类代谢物的图谱。

3 代谢组学对胚胎发育潜能的研究

3.1 MS分析胚胎培养液氨基酸浓度与胚胎发育潜能的关系 氨基酸参与胚胎发育的多种重要生理过程，因此氨基酸代谢水平可在一定程度上反映胚胎的发育潜能。Houghton等[9]利用高效液相色谱技术(HPLC)测定不同发育阶段胚胎的氨基酸水平，认为不同发育阶段胚胎氨基酸的分泌与吸收与囊胚形成有关，并能预测胚胎发育潜能。Brison等[10]发现，甘氨酸、亮氨酸浓度水平降低和天冬氨酸浓度水平升高能够提高临床妊娠率和活产率。有研究表明，胚胎受精后第1～3天培养液氨基酸浓度变化与胚胎的种植潜能有关[11]，测定卵裂早期胚胎氨基酸代谢能预测胚胎发育潜能。

关于受精后第3～5天胚胎氨基酸代谢水平与胚胎发育潜能的关系的研究，有学者提出胚胎“静止”假说[12]，认为有发育潜能的胚胎其物质代谢水平反而低，这可能与有发育潜能的胚胎受到的损伤小，用于修复所需的物质和能量较少有关。Houghton等[9]对8细胞期到桑葚期胚胎的研究发现，此期胚胎氨基酸的消耗量越小，则其发育成囊胚的潜能越大，未能发育成囊胚的胚胎在此期消耗的氨基酸是发育成囊胚的胚胎的2倍。

Sturmey等[13]研究表明，囊胚期胚胎的氨基酸代谢水平与其DNA的损伤程度呈正比。Stokes等[14]通过检测冷冻胚胎复苏后的胚胎培养液氨基酸，发现发育至囊胚的复苏胚胎的培养液氨基酸谱与其先前研究报道的新鲜胚胎一致，用谷氨酸、甘氨酸和丙氨酸的转化总量预测哪些解冻后胚胎发育至囊胚，不论解冻后胚胎分级情况，以此预测囊胚形成的准确率可达到87%。Brison等[10]回顾性分析多胚胎移植后剩余胚胎培养液的氨基酸，发现甘氨酸、天冬氨酸和亮氨酸与临床妊娠率和活产率有关。

综上所述，适合胚胎发育过程中所需要的氨基酸含量可能会提高囊胚形成率和临床妊娠率，非侵入性的氨基酸代谢分析能够预测胚胎发育潜能，从而提高胚胎种植率。

3.2 光谱分析技术对胚胎发育潜能的评价作用 常用的光谱分析技术主要有近红外(NIR)光谱分析技术、傅立叶变换红外(FTIR)光谱分析技术和Raman光谱技术等。每种化学分子的化学结构决定其暴露射线时吸收射线增加的振动能量和振动特征频率，通过检测其吸收电磁射线的强度和波长位置，进而确定其相应的分子功能基团，如O-H、R-H、S-H和N-H,能对多种样品进行快速无创定量定性分析。一项多中心参与的前瞻性研究表明，应用红外光谱分析技术测定D3胚胎移植后的培养基中的胚胎代谢成分与妊娠率相关。光谱图显示妊娠胚胎和非着床胚胎存在显著不同，主要表现为-NH、-CH和-OH的浓度存在明显差异，这些差异的光谱区域经专业多线性回归软件定量分析后转换为单个胚胎的活力指数，结果显示着床胚胎平均活力指数明显高于未着床胚胎[15]。

Seli等应用红外光谱技术与遗传学算法，建立了一套可准确获得不同发育阶段的胚胎的代谢谱和活力指数的预测软件模型，认为活力指数高的妊娠结局明显好于活力指数低的胚胎，且与胚胎形态学评分无关[16]。进一步的研究表明，胚胎代谢组活力指数结合形态学评估方法比单用胚胎形态学评估方法预测妊娠结局准确性更高[17]。

3.3 NMR技术在评价胚胎发育潜能的研究 NMR分析技术是基于原子核的磁特性对生物体液或组织进行无创多变量分析，利用核磁共振谱图自动提供代谢物的结构及数量信息。Seli等[18]利用H-NMR分析技术回顾性比较妊娠组胚胎培养液和未妊娠组胚胎培养液，发现两组图谱显著不同，H-NMR技术预测胚胎发育潜能的敏感度和特异性均达到88.2%。Chertkov等用H-NMR技术分析第5天不同形态的囊胚培养液，发现每例NMR光谱可区别出葡萄糖、丙酮酸、乳酸、甘氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、及谷氨酸，研究结果表明胚胎的发育潜能与不同胚胎的代谢物含量相关。

4 小结

代谢组学作为一种新兴的技术与方法，在辅助生殖技术中具有很好的应用前景。胚胎的发育和代谢是个动态过程，不同发育阶段胚胎的检查结果和不同技术的检测结果可能不大相同，需要对不同发育阶段的胚胎代谢产物应用标准化的检测技术进行大样本分析。与现在常用的胚胎形态学评估方法相比，代谢组学技术能客观、全面、准确、无创地反映胚胎的发育潜能，可作为胚胎形态学评估的补充，从而提高胚胎种植率，提高单胚胎移植的妊娠率。

[1] Templeton A. Avoiding multiple pregnacies in ART:replace as many embryos as you like-one at a time[J]. Hum Reprod, 2000,15(8):1662.

[2] Abha M, Siriol G, Siladitya B.Global variations in the uptake of single embryo transfer[J]. Hum Reprod Update, 2011,17(1):107-120.

[3] Basak B, Daniel B, Gloria C, et al. The Istanbul consensus workshop on embryo assessment: proceedings of an exper meeting[J]. Hum Reprod, 2011,26(6):1270-1283.

[4] Guerif F, Gouge A, Giraudeau B, et al. Limited value of morphological assessment at days 1 and 2 to predict blastocyst development potential: A prospective study based on 4042 embryos[J]. Hum Reprod, 2007,22(7):1973-1981.

[5] Tang HR, Wang YL. Metabonomics: a Revolution in Progress[J]. Prog Biochem Biophys, 2006,33(5):401-417.

[6] Fiehn O, Kopka J, Dormann P, et al. Metabolite profiling for plant functional genomics[J]. Nat Biotechnol, 2000,18(11):1157-1161.

[7] Xu GW, Lu X, Yang SL. Recent advances in metabonomics[J]. Acta A and Med Sin, 2007,29(6):701.

[8] Dunn WB. Current trends and future requirements for the mass spectrometrics investigation of microbial, mammalian and plant metabolomes[J]. Phys Biol, 2008,5(1):1-24.

[9] Houghton FD, Hawkhead JA, Humpherson PG, et al. Non-invasive amino acid turnover predicts human embryo developmental capacity[J].Hum Reprod, 2002,17(4):999-1005.

[10] Brison DR, Houghton FD, Falconer D, et al. Identification of viable embryos in IVF by non-invasive measurement of amino acid turnover[J]. Hum Reprod, 2004,19(10):2319-2334.

[11] Marhuenda Egea FC, Martinez Sabater E, Gonsalvez Alvarez, et al. A crucial step in assisted reproduction technology: human embryo selection using metabolomic evaluation[J]. Fertil Steril, 2010,94(2):772-774.

[12] Baumann CG, Morris DG, Sreenan JM, et al. The quiet embryo hypothesis: molecular characteristics favoring viability[J]. Mol Reprod Dev, 2007,74(10):1345-1353.

[13] Sturmey RG, Hawkhead JA, Barker EA, et al. DNA damage and metabolic activity in the preimplantation embryo[J]. Hum Reprod, 2009,24(1):81-91.

[14] Stokes PJ, Hawkhead JA, Fawthrop RK, et al. Metabolism of human embryos following cryopreservation:Implications for the safety and selection of embryos for transfer in clinical IVF[J]. Hum Reprod, 2007,22(3):829-835.

[15] Seli E, Sakkas D, Scott RT, et al.Non-invasive metabolomic profiling of embryo culture media using Raman and near-infrared spectroscopy correlates with reproductive potential of embryos in women undergoing in vitro fetilization[J]. Fertil Steril, 2007,88(5):1351-1357.

[16] Seli E, Vergouw CG,Morita H, et al. Non-invasive metabolomic profiling as an adjunct to morphology for noninvasive embryo assement in women undergoing single embryo transfer[J]. Fertil Steril, 2010,94(2):535-542.

[17] Seli E, Bruce C, Bortros L, et al. Receiver operating characteristic(ROC) analysis of day 5 morphology grading and metabolomic viability score on predicting implantation outcome[J]. J Assit Reprod Genet, 2011,28(2):137-144.

[18] Seli E, Bottros L, Sakkas D, et al. Noninvasive metabolomic profiling of embryo culture media using proton NMR correlates with reproductive potential of embryos in woman undergoing in vitro fertilization[J]. Fertil Steril, 2008,90(6):2183-2189.

江苏省妇幼保健科研项目(F201347)；南通市科技计划项目(HS2013012)。

丁家怡

10.3969/j.issn.1002-266X.2015.01.043

R711.6

A

1002-266X(2015)01-0098-03

2014-08-07)