马文超，刘同祥，徐雁，王小龙，李维政，谢地诚

(1潍坊医学院，山东潍坊 261041；2潍坊市人民医院)

心肌缺血/再灌注损伤大鼠心肌组织PGC-1α的表达变化及意义

马文超1，刘同祥2，徐雁1，王小龙1，李维政1，谢地诚1

(1潍坊医学院，山东潍坊 261041；2潍坊市人民医院)

摘要：目的观察心肌缺血/再灌注损伤大鼠心肌组织过氧化物酶体增殖物受体γ(PPARγ)辅助激活因子1α(PGC-1α)的表达变化，并探讨其意义。方法 将21只Wistar大鼠随机分为缺血/再灌注模型组(I/R组)、GW9662组、假手术组，各7例。I/R组采用在体结扎左前降支方法建立缺血/再灌注大鼠模型，结扎左前降支使其缺血30 min，再灌注120 min；GW9662组建立模型1 d前静脉注射GW9662，剂量0.3 mg/kg；假手术组开胸绕过左前降支不做冠状动脉结扎，剩余步骤同I/R组。RT-PCR法检测各组大鼠心肌组织PGC-1α mRNA，Western blotting法检测各组大鼠心肌组织PGC-1α蛋白，ELLSA法测定各组大鼠血清中肌钙蛋白I。结果 I/R组、GW9662组、假手术组PGC-1α mRNA分别为1.70±0.09、1.00±0.07、0.86±0.03，PGC-1α蛋白分别为2.80±0.21、1.00±0.15、0.65±0.05，I/R组、GW9662组与假手术组比较，I/R组与GW9662组比较，P均<0.05。I/R组、GW9662组PGC-1α mRNA及蛋白表达与其血清中cTnI水平呈负相关(P均<0.05)。结论 心肌缺血/再灌注损伤大鼠心肌组织中PGC-1α表达上调，与血清中cTnI水平呈负相关，具有心脏保护作用。

关键词：过氧化物酶体增值激活受体γ辅助活化因子1α；缺血/再灌注损伤；肌钙蛋白I

心肌缺血/再灌注损伤是临床心肌梗死患者PCI术后冠状动脉再通中常见的生理、病理现象，目前认为心肌能量代谢障碍是缺血/再灌注损伤的始发环节[1]。线粒体是提供细胞能量最重要的细胞器，因此通过对线粒体能量代谢的靶向治疗成为了当前研究预防、治疗心肌缺血/再灌注损伤的热点。过氧化物酶体增殖激活受体γ(PPARγ)辅助活化因子1α(PGC-1α)是一种核辅激活因子，属于PPARγ家族的一员。研究[2]发现，PGC-1α在调节生理和病理条件下的心肌能量代谢中起重要作用，是线粒体的主要调控因子。本实验观察了心肌缺血/再灌注损伤大鼠心肌中PGC-1α的表达变化，并探讨其意义。

1材料与方法

1.1主要药品和试剂TRIzol试剂、RT-PCR试剂盒、肌钙蛋白(cTn)I检测试剂盒购自上海劲马实验设备有限公司；DNA Marker DL1000购自晶美公司；成年雄性Wistar大鼠21只，鼠龄8周，体质量(260±40)g，由潍坊医学院动物实验中心提供。

1.2缺血/再灌注动物模型建立和分组将21只大鼠随机分为3组。①缺血/再灌注组(I/R组)：将大鼠以10%水合氯醛麻醉(3.5 mL/kg)，仰卧位固定，将银针电极插入四肢皮下，连接MS4000U生物信号定量记录系统。分离气管并插管后立即行正压人工呼吸(呼吸频率70次/min，潮气量20 mL/kg，呼吸比1∶1)。从左侧3、4肋间打开胸腔，暴露心脏，剪破心包膜，在肺动脉圆锥左缘与左心耳右缘之间、平左心耳下缘2 mm处进针，进针深度1～2 mm、宽度2～3 mm，用5/0无损伤缝合线穿过心肌层，绕过冠状动脉左前降支结扎。心电图显示ST-T抬高、T波高耸，提示结扎成功。30 min后解除结扎，使冠脉再灌注120 min，再灌注时局部组织充血。以心肌颜色恢复，心电图ST段下降50%以上提示再灌注的成功。再灌注结束后迅速剪下心脏，在心室前壁相同位置留取心肌组织液氮冷冻，分别提取蛋白及组织RNA。②GW9662组：建立模型1 d前静脉注射PPARγ特异性阻断剂GW9662，剂量0.3 mg/kg，剩余步骤同I/R组。③假手术组：开胸绕过左前降支不做冠状动脉结扎，剩余步骤同I/R组。

1.3各组大鼠心肌组织PCR-1α mRNA检测采用TRIzol提取大鼠心肌组织中总RNA，紫外线分光光度仪测定RNA浓度，并采用Promega试剂盒逆转录cDNA，后以cDNA为模板进行PCR反应。利用Primer5.0进行引物设计。RT-PCR反应条件：94 ℃预变性5 min，各样品同时扩增。RT-PCR产物经1.5%的琼脂糖凝胶电泳，并在凝胶成像系统扫描分析扩增产物条带，分别测定各扩增带吸光度值，将目的基因的扩增条带与内参照β-actin扩增条带吸光度比值作为其mRNA相对表达量。

1.4各组大鼠心肌组织PGC-1α蛋白检测采用Western blotting法。组织匀浆，BCA法蛋白定量，蛋白制样，配制SDS-PAGE凝胶，上样量40 μg/lane，采用电泳系统80 V 45 min进行浓缩，120 V 80 min进行电泳分离。转膜，封闭，加PGC-1α一抗，稀释浓度1∶1 000，加二抗杂交，化学发光显色，以相对比值进行相对定量。

1.5各组大鼠血清cTnI检测实验结束时(再灌注末)，经腹主动脉快速抽取动脉血3~4 mL，以3 000 r/min离心15 min，分离血清，置-70 ℃冰箱中保存，按照ELLSA检测试剂盒说明书进行操作检测cTnI。

2结果

各组大鼠PGC-1α mRNA及蛋白水平比较见表1。I/R组、GW9662组、假手术组cTnI分别为(0.28±0.01)、(0.32±0.02)、(0.06±0.02)μg/L，I/R组、GW9662组与假手术组比较，P均<0.01；GW9662组与I/R组比较，P<0.05。I/R组PGC-1α mRNA表达与其血清中cTnI含量呈负相关(r=-0.92，P=0.003)；GW9662组PGC-1α mRNA表达与其血清中cTnI含量呈负相关(r=-0.21，P=0.031)；假手术组PGC-1α mRNA表达与其血清中cTnI含量无相关性(r=0.41，P=0.357)。I/R组PGC-1α蛋白表达与其血清中cTnI含量呈负相关(r=-0.98，P=0.000)；GW9662组PGC-1α蛋白表达与其血清中cTnI含量呈负相关(r=-0.93，P=0.003)；假手术组PGC-1α蛋白表达与其血清中cTnI含量无相关性(r=0.62，P=0.142)。

注：与假手术组比较，*P<0.05；与I/R组比较，△P<0.05。

3讨论

目前认为，心肌缺血/再灌注损伤过程中伴随着能量代谢一系列异常的变化，心肌缺血实施再灌注在挽救存活细胞的同时也损伤细胞。心肌缺血/再灌注能够引起线粒体代谢异常导致心肌能量障碍，发生细胞凋亡和坏死，线粒体作为缺血/再灌注损伤靶点的重要性目前已经得到了共识[3]。线粒体在缺血、缺氧状况下，由于心肌ATP生成减少，Ca2+大量涌入，出现功能障碍、受损及数量减少，为氧自由基损伤、Ca2+超载、再灌注心律失常的发生创造了基础条件，成为心肌损伤的始发环节[2]。而作为线粒体的生物主导协调因子——PGC-1α在线粒体功能及增长中发挥着重要作用，是心脏能量代谢的关键调节器，可直接对生物刺激调控线粒体的合成和表达做出相应反应[4～7]。

本实验发现，心肌缺血/再灌注损伤后PGC-1α的mRNA和蛋白表达也随之上调。说明当心肌急性缺血损伤后，通过PPARγ等途径，使心肌细胞中PGC-1α mRNA的表达上调，活化PGC-1α蛋白的能力上调，并进一步激活下游核呼吸分子(NRFs)、线粒体转录因子A(Tfam)[8,9]、活化雌激素等相关受体等转录因子，从而促进线粒体的合成代谢、葡萄糖的利用以及脂肪酸氧化等一系列生理过程，进而调节心肌能量代谢。PGC-1α过表达还可以使ATP/ADP跨膜转运增加，抑制内皮细胞的凋亡[6]。

cTn是心肌收缩调节蛋白，存在于肌凝蛋白和肌纤蛋白表面，含cTnT、cTnI、cTnC这3个亚单位，共同调节心肌收缩，其中cTnI是心肌特有的。当心肌细胞损伤时，cTnI能够快速释放入血，在血清中浓度升高，其升高程度与心肌损伤程度成正比。cTnI是心肌损伤的特异性标志物，常被称为是鉴别心肌损伤的“金标准”[10]。本实验通过测定3组大鼠血清中cTnI水平来评价心肌损伤程度。结果显示，I/R组、GW9662组PGC-1α表达均上调，且均与血清cTnI水平呈负相关，提示PGC-1α能够抑制心肌缺血/再灌注损伤，阻止cTnI外流至血液中，进一步证实了PGC-1α具有保护心脏作用，但其作用机制仍需进一步研究。

已有研究发现，PPARγ激动剂吡格列酮能够通过激动PPARγ上调PGC-1α，并有抗心肌凋亡作用，这为预防及治疗糖尿病患者PCI术后心肌缺血/再灌注损伤提供了新的思路[11]。根据本实验推测，心肌急性缺血/再灌注损伤过程中会激动上调PGC-1α表达，通过调节线粒体内能量代谢，促进线粒体的合成生长，从而改善心肌能量障碍，起到保护心脏的作用。

综上所述，心肌缺血/再灌注损伤过程中PGC-1α表达上调，PGC-1α表达与血清中cTnI水平成负相关，具有保护心脏作用，但PGC-1α随着缺血时间延长能否持续上调表达，有待完善实验及分组做进一步研究。

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(收稿日期：2014-11-26)

通信作者：刘同祥

中图分类号：R318

文献标志码：A

文章编号：1002-266X(2015)07-0029-03

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2015.07.010