李大登，马俊，魏小妹(江陵县人民医院，湖北江陵43400;武汉市医疗救治中心)

PCR-线性杂交酶显色法检测结核分枝杆菌耐药性效果分析

李大登1，马俊2，魏小妹1
(1江陵县人民医院，湖北江陵434100;2武汉市医疗救治中心)

摘要:目的探讨PCR-线性杂交酶显色法(以下称显色法)检测结核分枝杆菌对异烟肼及利福平耐药性的临床价值。方法选择结核病患者的临床痰标本471份，其中结核分枝杆菌分离株120株(分离株)、痰涂阳性标本351份(痰涂标本)。采用显色法对两种标本行异烟肼及利福平耐药性检测，以传统的比例法药敏试验作为金标准，比较两种方法所用的检测时间，分析显色法检测的灵敏性、特异性、阳性预测值及阴性预测值。结果显色法对分离株及痰涂标本耐药性的检测时间均少于比例法(P＜0.01)。显色法检测分离株中异烟肼耐药的灵敏性、特异性、阳性预测值与阴性预测值分别为93.33%、100%、100%及97.83%，利福平分别为90.91%、100%、100%及98%;痰涂阳性标本中异烟肼耐药的灵敏性、特异性、阳性预测值与阴性预测值分别为83.33%、97.97%、88.24% 及97%，利福平分别为89.66%、97.27%、86.67及97.94。结论显色法检测结核分枝杆菌对异烟肼、利福平耐药的灵敏性和特异性均较高，可在24 h内获得检测结果，是一种快速、可靠检测结核分枝杆菌耐药的方法。

关键词:线性杂交酶显色法;结核分枝杆菌;异烟肼;利福平;抗药性

异烟肼及利福平是治疗结核的一线药物，结核分枝杆菌对其产生耐药是影响结核病治疗效果的主要原因［1］。传统的药物敏感试验采用比例法检测结核分枝杆菌的耐药性，但检测周期长，易延误治疗时间。PCR-线性杂交酶显色法(GenoType®MTBDRplus法，以下称显色法)是一种快速、可靠的检测结核分枝杆菌耐药性的方法［2，3］。2011年7月～2014年5月，我们采用显色法检测了肺结核患者痰标本中结核分枝杆菌对异烟肼及利福平的耐药情况，探讨该方法在结核分枝杆菌耐药性检测中的应用价值。

1　资料与方法

1.1临床资料选择同期就诊于武汉市医疗救治中心的疑似肺结核病患者［男295例、女255例，年龄14～83(47±6.43)岁］的临床痰标本471例份，其中结核分枝杆菌分离株(以下称分离株) 120株，痰涂阳性(金铵“O”染色阳性)标本351例份(以下称痰涂标本)。

1.2耐药性检测对所有标本分别采用显色法及比例法药敏试验行异烟肼和利福平耐药性检测。

1.2.1显色法严格按照操作手册进行，主要分为4步:超声波水浴破菌提取DNA、对模板进行PCR扩增、将扩增产物进行杂交显色、结果判读。如试纸条上所有的野生型条带显色而突变型条带不显色，则将该菌株判定为敏感株。如对应药物的野生型条带不显色或突变型条带显色，则将该菌株判定为耐药菌株。如试纸条上TUB质控带为阴性，表示所试细菌不属于结核分枝杆菌复合群，需排除。

1.2.2比例法严格按常规步骤操作，主要分为4 步:菌悬液制备、菌液稀释、接种培养、报告结果。如耐药百分比大于1%，则认为受试菌对该抗结核药耐药。

1.3检测效果分析比较两种方法所用的检测时间。以比例法检测结果为金标准，采用交叉列表对比法，分析显色法检测异烟肼及利福平耐药性的检测效果，灵敏性=(真耐药数+假敏感数)/真耐药数×100%，特异性=(真敏感数+假耐药数)/真敏感数×100%，阳性预测值=(真耐药数+假耐药数)/真耐药数×100%，阴性预测值=(真敏感数+假敏感数)/真敏感数×100%。

1.4统计学方法应用SPSS19.0软件，计量资料比较采用独立样本t检验，计数资料比较采用χ2检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1检测时间显色法对分离株与痰涂标本的检测时间分别为(6.12±1.23)、(6.24±1.32) h，比例法分别为(2.12±0.64)、(4.03±2.13)个月，显色法对分离株及痰涂标本耐药性的检测时间均少于比例法(P＜0.01)。

2.2分离株耐药性显色法检测出对异烟肼耐药28株、利福平耐药20株，比例法分别为30、22株，显色法检测分离株对异烟肼耐药的灵敏性、特异性、阳性预测值及阴性预测值分别为93.33% (28/30)、100%(90/90)、100% (28/28)及97.83% (90/92)，利福平分别为90.91% (20/22)、100% (98/98)、100%(20/20)及98%(98/100)。

2.3痰涂标本耐药性显色法检测出对异烟肼耐药45例份、利福平耐药52例份，比例法分别为54、58例份。显色法检测痰涂标本对异烟肼耐药的灵敏性、特异性、阳性预测值及阴性预测值分别为83.33%(45/54)、97.97% (291/300)、88.24% (45/51)及97%(291/300)，利福平分别为89.66% (52/58)、97.27% (285/293 )、86.67% (52/60 )及97.94%(285/291)。

3　讨论

目前，结核分枝杆菌耐药性已成为导致结核病疫情上升及病情难以控制的一个重要原因［4～6］。异烟肼与利福平是一线抗结核治疗的主要药物，临床应用较为普遍，因此两药的耐药性较常见，耐药率也较高［7～9］。研究发现，约30%的结核病患者对异烟肼与利福平耐药，可能与临床对以异烟肼及利福平为主的短程化疗方案的过度滥用有关［10］。因此，为更好地应用异烟肼与利福平、降低结核分枝杆菌的耐药性，应采用快速、有效的耐药性检测技术以早期发现耐药性。

比例法是WHO推荐的药敏试验方法，是临床判断结核分枝杆菌是否耐药的金标准。但该方法检测步骤较多、检测人员工作量大，且检测时间长，一般需2～4个月，导致在检测期间选择临床用药时无法及时调整治疗方案，可能延误结核病的治疗。显色法是基于PCR-线性探针杂交原理检测耐药基因的检测技术［11～14］，可通过检测对利福平耐药的rpoB基因和对异烟肼耐药的katG、inhA基因是否突变判断结核分枝杆菌的耐药性，可在24 h内完成耐药性检测。采用显色法可直接从涂阳痰标本及分离株中检测耐药基因，节省了分离培养的时间，使检测结果的报告时间比比例法缩短了2～4周。本研究发现，显色法6 h左右即可报告检测结果，而比例法则需要2～4个月，表明显色法可以更早地获得耐药性检测结果，有利于临床及时调整用药。采用显色法检测分离株异烟肼、利福平耐药性的灵敏性、特异性、阳性预测值与阴性预测值均较高，对痰涂标本检测的灵敏性、特异性、阳性预测值与阴性预测值亦较高但均低于分离株。

综上所述，显色法检测结核分枝杆菌对异烟肼、利福平耐药的灵敏性和特异性均较高，可在24 h内获得检测结果，是检测结核分枝杆菌耐药性快速、有效的方法。

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(收稿日期:2014-10-20)

文章编号:1002-266X(2015) 18-0075-02

文献标志码:B

中图分类号:R978.3

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.18.028