梁晓华，王云虎，李学梅，徐成东*

(1. 楚雄师范学院化学与生命科学学院，云南 楚雄675000;

2. 滇中高原生物资源开发与利用研究所，云南 楚雄675000;

3. 云南大学生命科学院，云南 昆明650091)

蕨类植物的叶表皮特征是其分类的重要理论依据之一。通过比较铁角蕨属的长生铁角蕨(Asplenium prolongatum)、石生铁角蕨(A. saxicola )、细裂铁角蕨(A. tenuifolium )、铁角蕨科的鸟巢蕨(A. nidus)、凤尾蕨科的溪边凤尾蕨(Pteris excelsa )和凤尾蕨(P. cretica var. nervosa )、蕨科的野稚尾金粉蕨(Onychium japonicum )和栗柄金粉蕨(O. lucidum)8 种蕨类植物的叶表皮微形态特征，分析总结其异同点，说明叶表皮微形态特征在蕨类植物分类中的作用。至今通过观察蕨类叶表皮微形态而对蕨类进行分类的研究也有相关报道，主要体现在1999 年张耀甲等人对我国本土的水龙骨科蕨类植物的气孔器类型及系统学意义做了一定的研究［1］;随后，李艳晖等人也对我国不同地区不同蕨类植物的叶表皮也做了一定的研究［2～3］;在这些研究中，对铁角蕨科及铁角蕨属植物叶表皮的微形态特征研究是比较少的，其中有2010 年王任翔等人对我国西南地区铁角蕨科蕨类植物叶表皮微形态特征做了相关的研究，同时也研究了其系统学意义等［4］。

植物组织临时装片技术是植物学研究的基础性技能和重要工具，在观察植物叶表皮细胞及其周围组织有重要的意义［5］。蕨类植物叶表皮的形态特征在不同种、不同属、不同科之间存在很大的差异，通过观察比较不同蕨类植物的叶表皮的形态特征，可以初步判断蕨类植物之间的亲缘关系，进而对蕨类植物做出分类。以此研究结果与已有的分类研究结果比较，发现其结果是否有所相符。与此相关的研究领域有对鳞毛蕨科8 种蕨类植物以及对凤丫蕨属6 种植物叶表皮特征的研究［6～7］。

叶片是植物基本的营养器官，对于蕨类植物，有些叶片还作为生殖的主要器官，叶片对蕨类植物的生存和繁殖有着不可替代的作用。同时，叶表皮的微形态，尤其是气孔器的特征也可作为蕨类植物分类的依据之一。因此对蕨类植物的叶表皮进行制片，观察其表皮的细胞形状、气孔器的特征有着重要的作用［8］。

本研究对铁角蕨属3 种蕨类植物和其它科属的蕨类植物的叶表皮特征进行初步研究比较，主要对其细胞形状、气孔器特征进行比较。同时，对容易生长孢子的蕨类植物的孢子也进行比较，以及比较各种蕨类植物的表皮是否有表皮毛，对结果进行分析比较与探讨［9～12］。

1. 材料与方法

1.1 材料

材料为铁角蕨属(Asplenium)三种植物:长生铁角蕨(A. prolongatum)、石生铁角蕨(A.saxicola )、细裂铁角蕨(A. tenuifolium )、铁角蕨科的鸟巢蕨(A. nidus)、凤尾蕨科的溪边凤尾蕨(P. excelsa)和凤尾蕨(P. cretica var. nervosa )、蕨科的野稚尾金粉蕨(O. japonicum )和栗柄金粉蕨(O. lucidum )。

1.2 器材、试剂

1.2.1 器材

UB100I Series 型光学显微镜、XXT -100X 型解剖镜、相机、载玻片、盖玻片、镊子、解剖剪、解剖刀、滤纸、擦镜纸、记录本、记录笔、毛笔、胶头滴管、烧杯、培养皿。

1.2.2 试剂

蒸馏水。

1.3 实验方法

1.3.1 叶片上、下表皮毛的观察及叶边缘的形态观察

分别选取长势良好、新鲜的8 种不同蕨类植物的成熟叶片，不作任何处理的放置在培养皿中，然后置于XXT-100X 型解剖镜下进行观察，分别观察其上下表皮是否有表皮毛，待调整观察到清晰画面时，做好观察记录。同时，在视野中找到叶片的边缘部分，由于有些蕨类植物的叶片比较大，并且多回生产复叶，所以只能选择叶片最小的单位，观察其边缘的形态，并做好记录。

1.3.2 叶片上、下表皮及附属物的观察

分别选取长势良好、新鲜的8 种不同蕨类植物的成熟叶片。有孢子的叶片，先记录孢子生长的部位，再用培养皿盛装置于XXT -100X 型解剖镜下对孢子进行观察，分别用不同倍数的物镜进行观察，直到观察到清晰完整的孢子形态，并拍照。然后用解剖刀轻轻刮去叶表皮的孢子，再用清水把叶片上下表皮的杂物洗净，自然风干，置于培养皿中用XXT -100X 型解剖镜对上下表皮进行观察，直至观察到清晰的叶表皮，拍照记录。

1.3.3 叶片上、下表皮细胞的制片观察

同样选取长势良好、新鲜的8 种不同蕨类植物的成熟叶片，对于有孢子的植物叶片，先用解剖刀轻轻刮去孢子，用清水洗净，自然风干。培养皿中盛装一定量的蒸馏水，待叶片自然风干，先用解剖剪从叶片的一端把叶片横向剪平，再用镊子分别轻轻撕取叶片的上、下表皮，每一侧的表皮尽可能多的撕取几片，撕取的上、下表皮分别置于两个盛有蒸馏水的培养皿中［10～12］。

取出载玻片和盖玻片洗净擦干，用胶头滴管在中央滴一滴蒸馏水，用毛笔挑取一片比较薄的表皮，置于载玻片的水滴上，用镊子夹取盖玻片盖上，制成临时装片(每一种临时装片尽可能多做几个，选择其中效果最好的一个进行进一步观察)。如果制作的临时装片水分太多，可以用滤纸从一侧把部分水分吸出。

把临时装片置于UB100I Series 型光学显微镜下观察。首先用低倍镜进行观察，找到装片比较满意的视野，把该视野移至物镜视野中央，转换高倍镜进行观察，待观察到清晰的细胞形态时，进行拍照。观察的同时，要注意寻找有无气孔的存在，若有，对清晰的气孔也进行拍照。

2. 结果与分析

2.1 叶片上、下叶表皮外形特征与叶缘特点

在所观察的8 种蕨类植物材料中，上、下表皮均未观察到表皮毛。其中，长生铁角蕨、石生铁角蕨、细裂铁角蕨和鸟巢蕨这4 种铁角蕨科的叶表皮有类似蜡质的物质，并且4 种叶片整体上显得比较肥厚，使得这4 种植物叶表皮的光泽比较好，叶肉也比较多。其它4 种蕨类植物与铁角蕨科的4 种植物相比，叶表皮光泽就显得比较暗，叶片也没有那么肥厚。

从成熟叶的最小单位的叶缘形态来看，长生铁角蕨的叶缘基本为平滑的直线;石生铁角蕨的叶缘呈不规则的钝齿状;细裂铁角蕨的叶缘也是直线的，在最小单位叶的尖端呈2 ～5 个不等的锯齿状;鸟巢蕨的叶缘呈微微的波浪状，幅度非常之小，又近似直线一样的形态。溪边凤尾蕨的叶缘则是小叶基部部分为直线状，靠近叶尖部分，叶缘呈锯齿比较浅的锯齿状，并且越靠近叶尖，锯齿直径越小，锯齿也越深;凤尾蕨在叶缘形态上亦是叶基部呈直线状，靠近叶尖则呈不规则的浅锯齿状;野稚尾金粉蕨的叶缘呈不规则的数目不等的钝齿状;栗柄金粉蕨在叶缘形态上呈比较规则的深锯齿状。

从孢子的形态来看，可能由于叶片在发育和分化上的原因，在所观察的8 种蕨类植物中，只在长生铁角蕨、石生铁角蕨、细裂铁角蕨和栗柄金粉蕨4 种植物中观察到了孢子的存在，且4 种蕨类植物的孢子都只存在于叶片下表皮，其他4 种尚未能观察到孢子的存在及形态。具体形态是:长生铁角蕨孢子为较细、较长的形态;石生铁角蕨的孢子呈细而长的形态;细裂铁角蕨的孢子呈较粗、较长的形态;栗柄金粉蕨的孢子则呈较粗、较短似椭圆的形态。

2.2 叶片上、下表皮细胞形态与气孔器特征

在实验所观察的8 种蕨类植物中，其细胞形状各不相同，气孔器特征也不尽相同。但所有蕨类植物的气孔器均分布在下表皮，上表皮均未发现气孔器的存在。

图Ⅰ UB100I Series 型光学显微镜下8 种蕨类植物叶表皮微形态(40 ×10)Fig. ⅠUB100I Series optical microscope 8 fern leaf epidermal micro morphology of (40 * 10)1，2. 长生铁角蕨;3，4. 石生铁角蕨;5，6. 细裂铁角蕨;7，8. 鸟巢蕨;9，10. 溪边凤尾蕨;11，12. 凤尾蕨;13，14. 野稚尾金粉蕨;15，16. 栗柄金粉蕨;1，3，5，7，9，11，13，15. 上表皮;2，4，6，8，10，12，14，16.下表皮1，2A. prolongatum;3，4 A. saxicola;5，6 A. tenuifolium;7，8A. nidus;9，10 P. excelsa.;11，12 P. cretica var. nervosa ;13，14 O. japonicum;15，16 O. lucidum;1，3，5，7，9，11，13，15.The upper epidermis;2，4，6，8，10，12，14，16.The lower epidermis;

由表2 -1 和图Ⅰ中可以看出，从细胞形状来看，长生铁角蕨的表皮细胞壁是凹凸的曲线状，整个细胞则表现为比较长的不规则的长条形，气孔周围分布有似月牙的特殊细胞(图Ⅰ-1);石生铁角蕨的表皮细胞壁亦是凹凸不规则的曲线，多数整体细胞表现为较长的不规则的长条形，少数整体细胞则表现为不规则的菱形(图Ⅰ-3);细裂铁角蕨的细胞壁也是凹凸不规则的曲线，多数整体细胞呈较细长的长条形，少数细胞则较不规则，一些位于气孔周围的细胞则呈两端比较钝的月牙形(图Ⅰ-5);鸟巢蕨的细胞壁亦呈凹凸不规则的曲线，从整体细胞来看，多数细胞比较粗短，细胞壁凹凸程度比较大，位于气孔周围的细胞亦有部分呈似月牙形(图Ⅰ-7)。

溪边凤尾蕨的细胞壁呈大幅度的凹凸曲线，整体细胞之间以类似齿轮的方式相接，个体细胞的四周分布比较不均匀(图Ⅰ-9);凤尾蕨的细胞壁仍然是凹凸幅度很大的曲线，细胞之间也是以类似齿轮的方式相接，但个体细胞分布极其不均匀(图Ⅰ-11);野稚尾金粉蕨的细胞壁呈凹凸曲线，上表皮细胞多数呈比较细长的长条形，而下表皮细胞多数为不规则的钝齿状，少数细胞表现为细长的长条形(图Ⅰ-13);栗柄金粉蕨的细胞壁依然是凹凸的曲线，上表皮亦多数呈细长的长条形，下表皮多数亦是不规则的钝齿状，少数为细长的长条形(图Ⅰ-15)。

由图Ⅰ中可以看出，从气孔器来看，长生铁角蕨的气孔器一般由两个副卫细胞围绕着保卫细胞，副卫细胞与其他细胞有很大差异，近似月牙状(图Ⅰ-2);石生铁角蕨的气孔器亦是由形状似月牙形的副卫细胞围绕着保卫细胞，副卫细胞区别于其他细胞(图Ⅰ-4);细裂铁角蕨的气孔器由数个副卫细胞围绕着保卫细胞，有一个或两个副卫细胞形似月牙，区别于其他细胞(图Ⅰ-6);鸟巢蕨的气孔器由数个形状不一致的副卫细胞围绕着保卫细胞，每一个气孔器至少有一个形似月牙的副卫细胞(图Ⅰ-8)。

溪边凤尾蕨的气孔器是由一个类似马蹄形的副卫细胞和其他正常的细胞围绕保卫细胞组成，类似马蹄形的细胞几乎包围了两个保卫细胞，且细胞的两侧都比较平滑(图Ⅰ-10);凤尾蕨的气孔器由一个内侧比较平滑，而外侧与其他细胞基本一致的副卫细胞和其他正常细胞围绕着保卫细胞而成，马蹄形的副卫细胞也几乎包围了两个保卫细胞(图Ⅰ-12);野稚尾金粉蕨的气孔器由一个内侧平滑似月牙，而外侧与其它细胞一致的副卫细胞和其它细胞组成，多数气孔器有3 个副卫细胞，少数有2 个或4 个副卫细胞(图Ⅰ-14);栗柄金粉蕨的气孔器由2 ～5 个不规则的副卫细胞组成，其中至少有一个副卫细胞的内侧平滑似月牙，外侧与其它细胞基本一致(图Ⅰ-16)。

3. 结论与讨论

综合以上实验观察以及对叶表皮细胞形状和气孔器特征的分析可以看出，不同科蕨类植物之间叶片的外部形态有很大的差异;不同蕨类植物之间在细胞形状和气孔器特征的形态上也有很大的差异;而同一种属或是同一科属之间都能够找到相似的形态结构。这些实验结果与分类学所研究的结果是一致的，由此说明以上特征可作为蕨类植物分类的重要理论依据。

从实验及观察结果来看，4 种铁角蕨科的植物叶片都比较肥厚，并且表面有一层似蜡质的物质，使得这4 种铁角蕨科的植物叶片光泽比较好，叶肉也比较多;而其它4 种蕨类的叶片与之相比更薄一些，叶肉也较少，叶片的光泽亦是比较差。

3 种铁角蕨属植物的细胞形状都是不规则的长条形，鸟巢蕨的细胞呈较粗短的形态，凤尾蕨科的两种植物的细胞均类似的不规则，且细胞间像齿轮一样相接在一起，而蕨科的两种植物的上表皮细胞呈长条形，下表皮细胞则多数呈不规则的钝齿状;观察到的3 种铁角蕨属植物的孢子形态均呈长条形，或较粗短，或较细长，相似度比较高;而另外观察到的栗柄金粉蕨的孢子则呈比较粗而短的似椭圆形的形态。因此，把这8 种蕨类植物分为不同的科属是合理的。

从气孔器来看，铁角蕨属气孔器的多数副卫细胞都有至少有一个是月牙形的，且这种月牙形的细胞区别于其它细胞;鸟巢蕨的气孔器也通常存在一个月牙形的区别于其它细胞的副卫细胞，且副卫细胞较3 种铁角蕨属植物的多;蕨科的两种植物气孔器的多数副卫细胞靠近内侧呈马蹄形包围着保卫细胞，且几乎完全包围了保卫细胞;而蕨科的两种植物则多数为不等细胞型气孔器。整体来看，8 种蕨类植物在气孔器特征上亦存在很大的差异，而在同一科的植物却能找到相似的气孔器特征，因此，根据气孔器的特征把他们分为不同的科属也是合理的。

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