张晓凤 樊 平 田 耘 陕西省中医医院肾病科(西安 710003)

肾复康Ⅱ号胶囊含药血清对骨髓间充质干细胞分泌肾脏保护性生长因子的作用

张晓凤 樊 平 田 耘 陕西省中医医院肾病科(西安 710003)

目的：探讨肾复康Ⅱ号胶囊含药血清对大鼠MSCs分泌肾脏保护性生长因子HGF、BMP-7的作用。方法：灌胃法制备肾复康Ⅱ号胶囊含药血清。采用密度梯度离心法分离和培养大鼠MSCs，取第三代MSCs，分别加入肾复康Ⅱ号胶囊含药血清和对照血清体外对MSCs进行培养，至第10d，应用RT-PCR法检测两组MSCs分泌HGF、BMP-7的mRNA表达情况进行比较。结果：培养10d后，肾复康Ⅱ号胶囊含药血清组培养的MSCs分泌HGF、BMP-7的mRNA表达高于对照组。结论：肾复康Ⅱ号胶囊含药血清可上调MSCs分泌肾脏保护性生长因子HGF、BMP-7的表达，从而对肾间质纤维化发挥修复作用。

间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是一类具有自我更新、多系分化和高度增殖的细胞，易于分离培养、扩增，移植时不存在组织配型、免疫排斥及伦理等问题，日益成为细胞移植和组织工程中的理想种子细胞[1]。MSCs以旁分泌方式分泌多种细胞因子和生长因子，促进周围细胞的存活，完成肾小管修复是其发挥肾间质纤维化治疗的主要机制[2]。MSCs的这种旁分泌作用与中药复方配伍治疗疾病的作用机制非常相似。有研究报道某些益气活血降浊的中药复方和温阳补肾的中药单体具有体外促进MSCs分泌细胞因子的作用[3, 4]。益肾散结法是中医治疗慢性肾脏病的常用法则, 基于此法则研制的中药复方肾复康Ⅱ号胶囊是治疗肾间质纤维化的有效方剂[5]。既往研究表明，肾复康Ⅱ号胶囊可减少肾脏局部转化生长因子β 1(transforming growth factorβ 1，TGF-β1) 和纤溶酶原激活物抑制剂1(plasminogen activator inhibitor1，PAI-1)的表达。本此利用含药血清技术研究肾复康Ⅱ号胶囊是否具有体外促进MSCs旁分泌HGF、BMP-7的作用，从而探讨益肾散结法与MSCs旁分泌HGF、BMP-7，促进肾小管修复之间的关系, 为中医益肾散结法治疗肾间质纤维化提供新的理论依据。

1 实验材料 1.1 材 料 主要仪器与试剂：医用超净工作台(苏州净化设备厂)，CO2恒温培养箱(德国HERA cell公司)，倒置相差显微镜(日本Olympus公司)，数显恒温水浴锅(上海跃进医疗器械公司)，DMEM / F12 1∶1培养基(美国Hyclone公司)，优质胎牛血清(美国Hyclone公司)，胰蛋白酶消化液(美国Sigmar公司)，青霉素和链霉素(美国Hyclone公司)，Real-time PCR 仪(美国,Applied Biosystems 7000)，稳压稳流电泳仪。

1.2 实验动物 MSCs取自于2周龄雄性Sprague-Dawley大鼠骨髓中，经体外分离、扩增培养。Sprague-Dawley 大鼠由第四军医大学实验动物中心提供。

1.3 药 物 肾复康Ⅱ号胶囊(菟丝子、丹参、王不留行、鳖甲、僵蚕、山萸肉各12g，金樱子、淫羊藿、炒杜仲、姜黄、莪术、赤芍各10g)，由陕西省中医医院药剂科提供。

2 实验方法 2.1 分 组 Wistar大鼠20只, 分为两组, 肾复康Ⅱ号胶囊组和生理盐水对照组, 分别灌服肾复康Ⅱ号胶囊溶液(450mg/kg·d)及等体积的生理盐水，1次/d, 连续10d。

2.2 含药血清及对照血清的制备 两组大鼠于末次给药后1h开胸心尖取血, 2500rpm离心25min，分离血清, 经56℃，30min灭活, 0.22μm滤膜过滤灭菌, -30℃保存备用。

2.3 MSCs的分离、纯化和培养 取2周龄雄性SD大鼠两只，颈椎脱臼法处死，浸泡于75%乙醇中15min后，置于超净台中；严格无菌条件下将大鼠下肢皮肤去除，股骨于髋臼处离断，置于无菌培养皿中。剪除软组织，剔除股部和腿部肌肉后分离出双侧股骨及胫骨；将分离的股骨和胫骨放于灭菌PBS中，浸泡5min。剪断股骨、胫骨两端骨骺露出骨髓腔，用5mL注射器吸引无血清的培养基，冲出骨髓组织，反复数次，至骨髓腔发白，1000rpm，离心5min，弃上清；在细胞沉淀中加入含10%FBS，1%青、链霉素的L-DMEM培养基，充分吹打制成单细胞悬液。细胞计数后，调细胞浓度以2×106/cm2的密度接种于25cm2的塑料培养瓶，置于37℃、5 %CO2饱和度的恒温培养箱中培养；接种24h后，首次半量换液，之后每3d换液1次。7～10d后待细胞融合达80%时，进行传代。传代过程如下：弃去培养液后，以37℃预热的PBS轻洗两次，加入含0.25%胰酶的消化液1mL，消化2min后，在倒置显微镜下观察到细胞皱缩变圆部分脱壁后，终止消化。轻吹打细胞后收集，1000rpm，离心5min，弃上清；加入10mL含15%FBS的培养基重悬，并以1∶2比例分瓶，即为第1代MSCs (passage 1)，记为P1，将培养瓶置于恒温培养箱中培养。4～5d后待细胞长满80%时，按以上步骤进一步培养传代。

2.4 含药血清对MSCs的体外旁分泌作用 将待处理的MSCs分别移至放有无菌盖玻片的6孔板中培养成单层，再分别加入肾复康Ⅱ号胶囊含药血清及对照血清，每隔48h换液。于第10d作以下检测：应用RT-PCR法检测肾复康Ⅱ号胶囊含药血清对MSCs分泌HGF、BMP-7的表达。收集血清处理后的各组细胞，加入1mL Trizol 提取总 RNA，紫光分光光度仪测定其纯度和含量，凝胶电泳检测其完整性。合成的引物序列如下：HGF上游引物5AAGAGTGGCATCAAGTGCCAG-3’,下游引物，5’-CTGGATTGCTTGTGAAACACC-3’；BMP-7上游引物，5’-CTCCACAGGTAGCACACATCAC -3’，下游引物，5’-CCACATCCAGAACCAGAGACTT-3’；GAPDH上游引物, 5’-GTGAAGGTCGGAGTCAACG-3’，下游引物，5’-TGAGGTCAATGAAGGGGTC-3’。总RNA样品用随机引物按RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit 说明合成cDNA 第一链，利用Primer-Express (ABI, Foster City, CA)设计引物，以其为模板应用Prism 7500 real-timePCR 仪进行实时PCR 反应。所用荧光试剂为SYBR-Green，逆转录cDNA 样品扩增至反应结束。然后以GAPDH 作为标准测定Ct(cycle threshold)值。以目的基因/GAPDH的比值衡量PCR反应产物。

3 结 果 3.1 MSCs的分离、纯化和培养 原代培养的MSCs 24h后开始贴壁，形态不均一，体积较小，或圆形，或多边形，或梭形，3d后可形成集落(图1-1)；7d时细胞呈长梭形。细胞融合达80%时，即可进行传代。传代后的MSCs增殖速度明显加快，细胞形态基本均一，呈纺锤形或长梭形，铺展状，活力好，可见少量未贴壁的杂细胞。通常情况下，MSCs每5～7d传代一次，通过换液和传代的方法可以纯化细胞。第3代MSCs形态均匀呈成纤维细胞样，旋涡状分布(图1)。

A：为P0代MSCs，可见细胞形态各异，B：为P3代MSCs，可见细胞形态均一，成旋涡状分布

图1 MSCs形态图

3.2 RT-PCR检测肾复康Ⅱ号胶囊含药血清对MSCs分泌HGF、BMP-7的作用 肾复康Ⅱ号胶囊含药血清组和生理盐水对照血清组分别培养细胞10d后，经PCR法检测，肾复康Ⅱ号胶囊含药血清具有促进MSCs分泌抗纤维化因子的作用，药物作用后的MSCs 分泌的HGF、BMP-7 等细胞因子表达明显上调，组间比较具有统计学差异(P<0.05)，见表1。

表1 MSCs的HGF、BMP-7 mRNA的表达

组别HGF/GAPDHBMP-7/GAPDH对照组0.137±0.0050.271±0.010实验组0.550±0.056△1.506±0.118△

注：与对照组比较，△P<0.05

4 讨 论 中医益肾、散结治则是用于治疗慢性肾脏病的常用法则, 旨在疏通病变部位的脉络, 改善局部生存状态, 与促进其分泌HGF、BMP-7，参与局部微环境的重建有相通之处。基于此法则而研制的肾复康Ⅱ号胶囊是临床治疗肾间质纤维化的有效方剂。本研究发现体外培养的MSCs在肾复康Ⅱ号胶囊含药血清的诱导下，分泌抗纤维化因子HGF、BMP-7的作用明显增强。HGF、BMP-7可与受损肾脏中的某些细胞因子结合刺激肾组织原位干细胞和残余肾小管上皮细胞完成肾小管修复作用。因此，我们认为，肾复康Ⅱ号胶囊含药血清具有体外诱导MSCs旁分泌HGF、BMP-7的作用，为将来协助MSCs移植治疗肾间质纤维化提供了可靠的手段和理论依据。

[1] Hung SC, Chen NJ, Hsieh SL,et al. Isolation and characterization of size-sieved stem cells from human bone marrow[J]. Stem cells (Dayton, Ohio), 2002, 20(3): 249-58.

[2] Cheng K, Rai P, Plagov A, et al. Transplantation of bone marrow-derived MSCs improves cisplatinum-induced renal injury through paracrine mechanisms [J]. Exp Mol Pathol, 2013, 94(3): 466-73.

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[4] 裴志勇, 赵玉生, 高 伟,等. 地黄低聚糖对人脂肪组织来源干细胞旁分泌作用的影响[J]. 中国临床保健杂志,2012,10(4): 388-391.

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(收稿2014-11-01；修回2014-11-20)

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10.3969/j.issn.1000-7369.2015.02.060