复方龙脉宁滴丸中葛根素和薯蓣皂苷纯化工艺研究*

2015-03-22董泰玮王昌利史亚军陕西中医学院咸阳712046

陕西中医 2015年2期

董泰玮王昌利史亚军陕西中医学院(咸阳712046)

董泰玮王昌利△史亚军陕西中医学院(咸阳712046)

目的：筛选复方龙脉宁滴丸中葛根素和薯蓣皂苷的纯化工艺。方法：采用HPLC分析方法，以葛根素和薯蓣皂苷含量为评价指标，分别对树脂类型、洗脱乙醇浓度、上样量、洗脱速度和洗脱体积影响因素进行优选。结果：优化的最佳工艺条件为用AB-8大孔树脂进行纯化，上样量与树脂比为1 mL：1g，以0.5 BV/h的速度80%乙醇洗脱，4BV可洗脱完全，葛根素回收率为96.62%，薯蓣皂苷回收率为97.79%。结论:此纯化工艺参数合理，重复性好，为复方龙脉宁滴丸进一步研究奠定了良好的基础。

复方龙脉宁滴丸是陕西中医学院附属医院脑病科陶根鱼教授在长期临床应用的基础上，通过基础研究筛选出来的主要针对心脑血管疾病，汤剂临床疗效好，经前期动物实验研究复方龙脉宁滴丸具有扩张血管和改善微循环的作用[1]。该复方由葛根、穿山龙、川芎、蜂胶四味药组成，葛根为方中君药，其有效成分是异黄酮类化合物，有大豆苷元、大豆苷、葛根素等，葛根素改善微循环障碍，冠状动脉扩张剂，增加冠状动脉血流量，减少心肌氧耗量，抑制血小板凝集[2]。方中穿山龙为佐药，有抗炎、扩张冠状动脉、抗动脉硬化、调节代谢等作用，其主要活性成分为甾体皂苷，薯蓣总皂苷改善冠脉血液循环，降低动脉压，减慢心率，增强心肌收缩的作用[3]。

本课题组前期对复方龙脉宁滴丸质量标准、纯化工艺进行研究[4-6]。但前期都是以复方提取液中葛根素为评价指标，而对于方中其他指标未进行考察。因此本实验以葛根素和薯蓣皂苷为评价指标，通过大孔吸附树脂纯化富集实验的思路，以期为进一步研究提供合理可行的参考依据。

1仪器与试药 1.1仪器日立双泵系统液相色谱仪(批号：LC-7000A)；PH计(奥立龙PHS-3C)；旋转蒸发器RE-3000；AR1140 Mettler Toledo电子天平，精密度：万分之一)；KH-400KDE型高功率数控超声清洗器。

1.2 试药葛根素对照品(批号:110773-201012)，薯蓣皂苷对照品(批号:111707-200501)，两种对照品均由中国药品生物制品检定所测定。葛根为豆科植物野葛的干燥根茎，穿山龙为薯蓣科植物穿龙薯蓣的干燥根茎，并经陕西中医学院药学院生药教研室王继涛教授鉴定。乙腈为色谱纯，水为蒸馏水,其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果 2.1色谱条件测定葛根素色谱条件：色谱柱HypersiL ODSC18(5μm，4.0mm×150mm)；甲醇-水流动相(25:75)；检测波长：250 nm；柱温：25℃；流速：1.0 mL/min[7]。

测定薯蓣皂苷的色谱条件：色谱柱HypersiL ODSC18(5μm，4.0mm×150mm)；乙腈-水流动相(54∶46)；检测所得波长210 nm；柱温度：25℃；流速：1.0 mL/min[8]。

2.2 溶液的制备对照品葛根素溶液的制备:葛根素标准品精密称取12.5 mg，用乙醇超声溶解，定容至25 mL，混匀；将该液精密吸取1 mL置于10 mL容量瓶，用乙醇定容，浓度为0.05 mg/mL，4℃冷藏备用。对照品薯蓣皂苷溶液:薯蓣皂苷对照品精密称取7.6 mg，用70%乙醇溶解，定容至10 mL,浓度0.76 mg/mL，4℃冷藏备用。

样品溶液的制备:在前期实验中，已经确定了提取工艺，取葛根300 g，川芎200 g，穿山龙200 g，以8倍量70%乙醇，提取3次，每次2 h，回收乙醇，浓缩至1000 mL[9]。该工艺中葛根素和薯蓣皂苷的提取率分别为4.26% 、1.38%。

2.3 方法学建立葛根素标准曲线的制备:葛根素对照品溶液精密吸取分别5 μL、10 μL、15 μL、20 μL、25 μL，按“2.1”项下色谱条件测定其峰面积，以峰面积A为纵坐标，葛根素含量C(μg)为横坐标，回归方程：A=107x+106，R2=0.9991，线性范围为0. 25 μg～1. 25 μg。薯蓣皂苷标准曲线的制备:精密吸取薯蓣皂苷对照品溶液5 μL、10 μL、15 μL、20 μL、25 μL，按“2.1”项所设色谱条件对峰面积进行测定，以峰面积A为纵坐标，薯蓣皂苷含量C(μg)为横坐标,得线性方程：C=488639x+433142，R2=0.9995，线性范围为值3.80 μg～19.00 μg。

精密度:对葛根素和薯蓣皂苷对照品进行精密吸取，各取10 μL，按“2.1”项下色谱条件测定峰面积，连续进样6次，得RSD值分别为0.78%和1.05%，表明仪器精密度良好。

稳定性:精密吸取“2.2”项下稀释后的样品溶液10 μL，分别于0 h、1 h、4 h、8 h、12 h进样，按“2.1”项下色谱条件测定葛根素和薯蓣皂苷峰面积，得RSD值分别为2.56%和1.89%，表明样品在12 h内稳定性较好。

重复性:按照“2.2”项下配比及提取方法制备样液，平行制取6份，以“2.1”项下色谱条件分别测定葛根素及薯蓣皂苷的峰面积，计算获得RSD值分别为2.32%和2.51%，表明样品重复性较好。

加样回收率:精密吸取供试品溶液1 mL，各2份，分别加入等量葛根素对照品溶液与薯蓣皂苷对照品溶液，混匀，按“2.1”项下色谱条件进样10μL，测定葛根素和薯蓣皂苷峰面积，经计算得葛根素的平均回收率为98.64%，RSD为2.71%。薯蓣皂苷的平均回收率为97.43%，RSD为0.24%。

2.4 洗脱条件的优选树脂的处理:分别取适量AB-8，D101大孔树脂，用95%乙醇浸泡24 h，装入洗脱柱，用95%乙醇冲洗，直至流出液1 mL加4 mL蒸馏水不呈白色浑浊为止，然后用蒸馏水以同样流速洗至无醇味，备用。

树脂类型的选择:分别取已处理好的AB-8，D101大孔树脂适量于两根柱子中，各加入2BV的药液，用10BV的70%乙醇洗脱，收集全部洗脱液，稀释10倍后，照“2.1”项下各色谱条件测定峰面积，进样2 μL测定葛根素含量，进样10 μL测定薯蓣皂苷的含量，测定结果见表1[2,10-12]。由表1可知两种树脂无明显差别，鉴于AB-8价格低于D101，选择AB-8树脂。

表1 大孔树脂类型的选择(mg)

树脂类型葛根素洗脱量薯蓣皂苷洗脱量AB-82.03304.2315D1011.99314.2203

洗脱浓度的选择:取2g处理好的树脂各7份，加入5 mL样品溶液充分吸附振荡，放置24 h。用清水洗去多余药液，加入30%、50%、60%、70%、80%、95%乙醇各10 mL，放置12 h，制样。照“2.1”项下各色谱条件测定峰面积，计算洗脱量，结果见表2。由表2可知葛根素的最佳洗脱浓度为80%的乙醇，薯蓣皂苷则为95%的乙醇，考虑到葛根为君药，且80%与95%乙醇洗脱时薯蓣皂苷差别不大，所以选择80%乙醇作为洗脱剂。

表2 不同醇浓度洗脱量

测定指标30%50%60%70%80%95%葛根素0.70230.29093.60114.44824.91760.0531薯蓣皂苷0.94570.92500.96330.97000.98200.9912

药材上样量的确定:分别取1g、2g、3g、4g、5g、6g树脂各加入5 mL药液振荡24 h，静置，取上清液，稀释10倍，照“2.1”项下各色谱条件测定葛根素和薯蓣皂苷峰面积，计算不同树脂中各指标的吸附率，确定上样药液和树脂比，结果见表3。由表3可知5 mL药液葛根素需要4 g树脂吸收，而薯蓣皂苷需5 g树脂，故上样量与药材比为1 mL：1g。

表3 上样量的选择

树脂量(g)葛根素吸附率(%)薯蓣皂苷吸附率(%)175.7540.61295.7263.45310082.80410092.5451001006100100

药材洗脱速度的确定:本实验采用静态吸附-动态解析的方法，按1g∶1 mL的树脂与药材比例上样后，分别以0.5 BV/h、1.0 BV/h、2.0 BV/h的速度洗脱，收6BV的洗脱液，照“2.1”项下各色谱条件测定峰面积，计算葛根素和薯蓣皂苷的洗脱率，结果见表4。由表4可知洗脱速度对葛根素的影响不大，对薯蓣皂苷的影响显著，故选择0.5 BV/h的洗脱速度。

表4 洗脱速度的选择

洗脱速度(BV/h)葛根素洗脱率(%)薯蓣皂苷洗脱率(%)0.588.9796.42176.7583.56257.9464.26

最佳洗脱量的选择:80%乙醇以0.5 BV/h的速度对过量饱和的AB-8树脂进行洗脱，1BV收集一份滤液，共收集8份，照“2.1”项下各色谱条件测定葛根素和薯蓣皂苷的峰面积，计算累积洗脱率，结果见表5。由表5可知4BV可洗脱完全，因此最佳洗脱量为4BV。

表5 洗脱体积的选择(%)

序号葛根素累积洗脱率薯蓣皂苷累积洗脱率190.8657.79299.6179.643100.1593.354100100.785100100610010071001008100100

3 讨论本实验针对处方中葛根素和薯蓣皂苷进行富集纯化，以便简化工艺，为复方龙脉滴丸的进一步研究提供依据。

大孔树脂的纯化原理是吸附和分子筛作用综合的结果,吸附作用是由于范德华力或氢键的作用让物质与树脂紧密结合；而分子筛作用则是由于树脂间的多孔结构减弱了物质之间的吸附力,使得有机溶剂易洗脱有效成分。本实验葛根素的最佳洗脱浓度为80%的乙醇，薯蓣皂苷则为95%的乙醇，葛根为君药，且80%与95%乙醇洗脱时薯蓣皂苷差别不大，所以选择80%乙醇作为洗脱剂。

适宜的上样液量是富集纯化目标成分的重要因素,既能防止有效成分的流失, 又能保证大孔树脂不浪费。本研究固定药液体积依次增加树脂用量来考察上样量，由实验结果表3可得上样量与树脂比值为1 mL∶1g时，两种成分吸附均较好。洗脱速率对于成分的迁移及分离具有重要影响，太快时成分很难达到理想的分离，过慢则易形成死吸附。本试验发现洗脱速度对葛根素的影响不大，而随着洗脱速率的逐渐增大，薯蓣皂苷的洗脱率显著减小，故选择0.5 BV/h的洗脱速度。合适的洗脱剂用量既可以对目标成分达到富集作用，又可以大量减少洗脱剂用量，以减少成本。由表5可知4BV可洗脱完全，若继续洗脱，不但会增加实验强度，而且会浪费很多溶剂，因此选择4BV进行洗脱。

综合以上影响因素，本试验通过静态吸附、动态解吸的方法,最终选择以AB-8树脂为复方龙脉宁滴丸的纯化树脂，80%乙醇以0.5 BV/h的速度上样量与树脂比为1 mL：1g进行洗脱，4BV可洗脱完全，此工艺条件下葛根素回收率为96.62%，薯蓣皂苷回收率为97.79%。该方法简单易行，重现性好，对生产和临床具有较好的参考意义。

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