关丽杰， 田 璐

(沈阳化工大学 制药与生物工程学院， 辽宁 沈阳 110142)

不同品种蘑菇的培养基质中胞外酶活性研究

关丽杰， 田 璐

(沈阳化工大学 制药与生物工程学院， 辽宁 沈阳 110142)

该研究分别从9种不同品种的蘑菇培养基质中提取几丁质酶和壳聚糖酶2种胞外酶并测定其酶活力.结果表明：平菇的培养基质中几丁质酶的活性最高，达33 U/g培养基质；金针菇的培养基质中壳聚糖酶的活性最高，达21.062 U/g培养基质.根据酶活测定的结果选取其中3种酶活较高的培养基质进行抑菌活性的研究.结果表明:3种培养基质的粗酶液对蜡样芽孢杆菌、番茄细菌性溃疡病菌和巨大芽孢杆菌3种病原菌均有抑制活性，且对巨大芽孢杆菌的抑菌活性最强.

蘑菇培养基质； 几丁质酶； 壳聚糖酶； 酶活力测定； 抑菌活性

几丁质(chitin)及壳聚糖(chitosan)是自然界中比较丰富的多聚糖，通过几丁质酶(chitinase)和壳聚糖酶(chitosanase)的作用,几丁质和壳聚糖将分别被降解为乙酰氨基葡萄糖和氨基葡萄糖.在某些植物病原菌的细胞壁中含有壳聚糖，在降解壳聚糖的方面，几丁质酶和壳聚糖酶之间没有明显的区别,二者均能降解不同乙酰化水平的壳聚糖[1]，达到抑制病原菌的目的.在植物中壳聚糖酶可以抵抗植物病原菌的感染，可作为植物功能调节剂，增强植物对病虫害的防御能力.因此，可以以此开发生产生物农药.而且壳聚糖酶是一种RP蛋白，可以提高植物的抗病能力[2].其降解产物几丁寡糖和壳寡糖具有许多生物活性，比如抗真菌、抗细菌、抗癌、抗感染、提高机体免疫力、降低胆固醇和促进钙的吸收等，且易溶于水，有吸湿性和保湿性，在食品、医药、农业和化妆品等领域有广泛的应用[3-11].

几丁质酶在一定的环境下能够水解几丁质,几丁质在害虫和植物病原真菌中广泛存在[12]，所以,几丁质酶在植物病虫害防治中具有重要作用.另外，通过生化方法制备高纯度的几丁质酶还可以作为外用药物,用于治疗人类由真菌引起的疾病.在国外,几丁质酶还用来处理几丁质废物,由于虾、蟹壳是细菌生长繁殖的有利场所,不有效处理废壳,极易对环境造成污染,采用几丁质酶进行水解处理,不仅彻底有效而且对环境没有影响[13-16].

本研究选取9种不同品种蘑菇的培养基质，旨在从中提取出几丁质酶及壳聚糖酶，并对其酶活性及其抑菌活性进行研究，为两种酶的进一步分离纯化做一些基础工作.

1 材料与方法

平菇(Pleurotusostreatus)、猴头菇(Hericiumerinacium)、真姬菇(Hypsizygusmarmoreus)、黄伞菌菇(Pholiotaadipose)、毛木耳(Auriculariapolytricha)、滑子蘑(Pholiotanameko)、大白桩菇(Leucopaxillusgiganteus)、金针菇(Flammulinavelutipes)、金顶侧耳(Pleurotuscornucopiaevar.citrinopileatus)9种蘑菇的培养基质.

病原菌包括大肠杆菌(Escherichiacoli)、蜡样芽孢杆菌(Bacilluscereus)、番茄细菌性溃疡病菌(Clavibactermichiganensissubsp.michiganensis)和巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)4种.

1.2 试 剂

乙二醇几丁质(EGC)购自日本WAKO公司；脱乙酰几丁质酶检测底物(AZCL-chitosan)购自爱尔兰Megazyme公司；N-乙酰-D-氨基葡萄糖(GlcNAc)、营养肉汤等试剂均为日本生产.

1.3 各种溶液的配制

(1) 硼酸钠溶液

（四）创新阶段：打造共建共治共享的社会治理格局。2012年，党的十八大提出“要围绕构建中国特色社会主义社会管理体系，加快形成党委领导、政府负责、社会协同、公众参与、法治保障的社会管理体制”。首先，首次提出了要构建中国特色社会主义社会管理体系，并系统地阐述了社会管理需要“法治保障”，这一新内容表明社会管理要与法治相结合。其次，提出要把社会管理和社会建设统一起来，以“创新社会管理”来促进社会建设。最后，指出要加强创新社会管理体制，提高社会管理的科学化水平，积极鼓励社会主体参与到社会管理中来。

称取4.95 g H3BO3溶于50 mL蒸馏水中，用1 mol/L NaOH调至pH 9.1.

(2) DMAB(4-二甲氨基苯甲醛)溶液

称取10 g DMAB溶于100 mL的HCl与冰醋酸混合溶液中，其混合比例为：V(10 mol/L HCl)/V(冰醋酸)=12.5 %.此溶液可在2 ℃保存2个月，使用时需用冰醋酸稀释10倍.

(3) 0.2 mol/L pH 5.0 醋酸-醋酸钠缓冲液

取0.2 mol/L 醋酸溶液30 mL和0.2 mol/L醋酸钠溶液70 mL，混匀.

1.4 几丁质酶及壳聚糖酶的提取方法

将10 mL 0.15 mol/L的NaCl溶液加入到1 g 培养基质中，于4 ℃冰浴研磨,研磨成匀浆后用无菌滤纸过滤，滤液置于无菌离心管中，10 000 r/min冷冻离心10 min，取上清液,用0.22 μm的细菌过滤器过滤，即制成几丁质酶及壳聚糖酶的粗酶液.

1.5 几丁质酶的酶活力测定

根据Reissig[17]的方法，反应体系的总体积为500 μL，包含125 μL 质量分数为0.2 %的乙二醇几丁质(EGC)溶液，125 μL 0.2 mol/L pH 5.0 的醋酸-醋酸钠缓冲液，100 μL H2O和150 μL酶液.30 ℃下水浴1 h,加入0.1 mL硼酸钠溶液，沸水浴3 min，终止反应移入冷水中，再加入3 mL DMAB溶液，混匀后37 ℃水浴20 min，移入冷水中后以蒸馏水为对照在544 nm处测吸光度值，根据N-乙酰-D-氨基葡萄糖(GlcNAc)标准曲线计算其酶活力.

一个酶活力单位(U)定义为：每克培养基质1 min内催化分解产生1 nmol GlcNAc的还原糖所需的酶量(nmol GlcNAc·min-1·g-1w).

1.6 壳聚糖酶的酶活力测定

在微量离心管中加入250 μL 0.2 mol/L pH 5.0 的醋酸-醋酸钠缓冲液，650 μL H2O，100 μL酶液和2 mg 脱乙酰几丁质酶检测底物(AZCL-chitosan)，在直立式旋转搅拌器上30 ℃反应5 h，然后将混合物在10 000 r/min下冷冻离心5 min，取上清液,以蒸馏水为对照在660 nm处测吸光度值，根据N-乙酰-D-氨基葡萄糖(GlcNAc)标准曲线计算其酶活力.

一个酶活力单位(U)定义为：每克培养基质1 min内催化分解1 μg AZCL-chitosan所需的酶量(μg Azcl-chitosan·min-1·g-1w).

1.7 粗酶液抑菌活性检测

在10 mL的营养肉汤培养基中分别接种大肠杆菌、蜡样芽孢杆菌、马铃薯环腐病菌和巨大芽孢杆菌，37 ℃、150 r/min摇床过夜培养.然后取150 μL的过夜细菌培养液加入到20 mL 44 ℃ 质量分数为1.5 %的琼脂培养基中，轻轻混匀后即制成混菌平板.用孔径为0.8 cm的无菌打孔器在凝固后的混菌平板上打孔，每个孔中注入150 μL的粗酶液，以同样的混菌平板每个孔中注入150 μL蒸馏水为空白对照，30 ℃培养72 h后记录抑菌情况.通过测量抑菌圈直径的大小，检测粗酶液抑菌活性.

2 结果与分析

2.1 9种不同品种蘑菇的培养基质中几丁质酶的酶活力

提取9种不同品种蘑菇培养基质的粗酶液，测定其几丁质酶的酶活力.研究发现：不同品种蘑菇的培养基质中所含的几丁质酶酶活力差异很大.由图1可看出：在从9种蘑菇的培养基质中所提取出来的粗酶液中，几丁质酶酶活力由高到低分别为平菇33 U/g培养基质，金针菇25.868 U/g培养基质，猴头菇21.131 U/g培养基质，滑子蘑9.695 U/g培养基质，真姬菇7.164 U/g培养基质，黄伞菌菇5.881 U/g培养基质，毛木耳4.086 U/g培养基质，金顶侧耳3.828 U/g培养基质，大白桩菇1.392 U/g培养基质.可见，平菇、金针菇和猴头菇的培养基质中几丁质酶的酶活均较高，由此推断在这3种蘑菇的培养基质中几丁质酶的含量较高.

1 平菇 2 猴头菇 3 真姬菇 4 黄伞菌菇 5 毛木耳 6 滑子蘑 7 大白桩菇 8 金针菇 9 金顶侧耳

图1 9种不同品种蘑菇的培养基质中几丁质酶的酶活力

Fig.1 The activity of chitinase from 9 species of mushroom waste medium

2.2 9种不同品种蘑菇的培养基质中壳聚糖酶的酶活力

用同样的方法提取9种不同品种蘑菇的培养基质的粗酶液，测定其壳聚糖酶的酶活力.研究发现：不同品种蘑菇的培养基质中所含的壳聚糖酶酶活力的差异也很大.由图2可看出：在从9种蘑菇的培养基质中所提取出来的粗酶液中，壳聚糖酶酶活力由高到低分别为金针菇21.062 U/g培养基质，猴头菇19.48 U/g培养基质，平菇8.095 U/g培养基质，毛木耳3.416 U/g培养基质，滑子蘑2.761 U/g培养基质，黄伞菌菇1.942 U/g培养基质，大白桩菇1.404 U/g培养基质，真姬菇0.975 U/g培养基质，而测得金顶侧耳的培养基质中壳聚糖酶的酶活为0，说明其培养基质中不含有壳聚糖酶.可见，除金针菇、猴头菇和平菇的培养基质中壳聚糖酶的酶活较高外，其余种类蘑菇的培养基质中壳聚糖酶的酶活均比较低,由此可以推断金针菇、猴头菇和平菇这3种蘑菇的培养基质中壳聚糖酶的含量较高，与几丁质酶的含量相吻合，故推断这两种酶在此3种蘑菇的培养基质中是同时存在的.

1 平菇 2 猴头菇 3 真姬菇 4 黄伞菌菇 5 毛木耳 6 滑子蘑 7 大白桩菇 8 金针菇 9 金顶侧耳

2.3 粗酶液抑菌作用

以大肠杆菌、蜡样芽孢杆菌、番茄细菌性溃疡病菌和巨大芽孢杆菌为病原菌，结合几丁质酶和壳聚糖酶活力的测定结果，选取几丁质酶及壳聚糖酶酶活均较高的培养基质，即平菇、猴头菇及金针菇的培养基质的粗酶液进行抑菌活性研究.

测量抑菌圈直径见表1.可见，3种蘑菇培养基质的粗酶液中平菇培养基质的粗酶液对大肠杆菌没有抑菌活性，但对其他3种病原菌均有抑菌活性，且对番茄细菌性溃疡病菌和巨大芽孢杆菌的抑菌活性差异不大，其中对番茄细菌性溃疡病菌的抑菌活性最高，抑菌圈直径达2.02 cm；其次是巨大芽孢杆菌，抑菌圈直径为1.92 cm；最后为蜡样芽孢杆菌，抑菌圈直径为1.15 cm.猴头菇培养基质的粗酶液对大肠杆菌也没有抑菌活性，但对其他3种病原菌均有抑菌活性，且差异不大，其中对巨大芽孢杆菌的抑菌活性最高，抑菌圈直径达2.20 cm；其次是番茄细菌性溃疡病菌，抑菌圈直径为2.03 cm；最后为蜡样芽孢杆菌，抑菌圈直径为1.85 cm.金针菇培养基质的粗酶液对4种病原菌均有抑菌活性，除对大肠杆菌抑制活性较小外，对其余3种病原菌的抑菌活性差异不大，其中对巨大芽孢杆菌的抑菌活性最高，抑菌圈直径达2.18 cm；其次是蜡样芽孢杆菌，抑菌圈直径为2.06 cm；再次是番茄细菌性溃疡病菌，抑菌圈直径为1.93 cm，最后是大肠杆菌，抑菌圈直径为1.31 cm.

通过以上结果可以看出：对于大肠杆菌，只有金针菇培养基质的粗酶液对其有轻微的抑制活性，而平菇和猴头菇的培养基质的粗酶液对其均没有抑制活性；对于蜡样芽孢杆菌，金针菇培养基质的粗酶液对其抑制活性最强，猴头菇次之，平菇最弱；对于番茄细菌性溃疡病菌，猴头菇培养基质的粗酶液对其抑制活性最强，平菇次之，金针菇最弱；对于巨大芽孢杆菌，猴头菇培养基质的粗酶液对其抑制活性最强，金针菇次之，平菇最弱.

表1 不同品种蘑菇培养基质粗酶液的抑菌活性

3 结 论

研究选取了9种不同品种蘑菇的培养基质，从中提取粗酶液后对其酶活进行检测，结果表明：相同品种蘑菇的培养基质中几丁质酶和壳聚糖酶的活性不同，其中几丁质酶活性最高的是平菇的培养基质，酶活达33 U/g培养基质；壳聚糖酶活性最高的是金针菇的培养基质，酶活达21.062 U/g培养基质.

结合酶活检测的结果，选取几丁质酶和壳聚糖酶活性均较高的3种蘑菇的培养基质，分别为平菇、猴头菇和金针菇的培养基质，提取粗酶液后进行抑菌活性研究.结果表明3种粗酶液对蜡样芽孢杆菌、番茄细菌性溃疡病菌和巨大芽孢杆菌均有抑制活性，除平菇培养基质的粗酶液对蜡样芽孢杆菌的抑制活性较小外，其余的抑菌活性均差异不大，抑菌圈直径均在2 cm左右；3种蘑菇的培养基质中，只有金针菇培养基质的粗酶液对大肠杆菌有抑制活性且较小外，其余2种均没有，说明这3种蘑菇培养基质的粗酶液对大肠杆菌的抑制效果均不好，但对其他3种病原菌的抑制效果均很明显.

在农业生产中，蘑菇的培养基质为废弃物，人们只能用它烧火或直接丢弃，对环境造成了严重污染且产生了巨大浪费.本研究从这些废弃物中提取出了应用广泛的几丁质酶及壳聚糖酶，起到废物回收利用的作用，减轻了环境的污染，对酶的研究及环境保护具有重要意义.

几丁质酶及壳聚糖酶不仅可以降解自然界中的几丁质和壳聚糖，产生许多有用的产物,而且有些几丁质酶和壳聚糖酶自身还兼具溶菌酶活性,可分解细菌细胞壁的肽聚糖,从而具有抗菌作用,对细菌、真菌、昆虫、螨等表现出一定抗性[18-19].目前，虽然对几丁质酶及壳聚糖酶的研究报道较多，但大多是从动植物及微生物中提取的，而本文是从蘑菇的废弃培养基质中提取，具有一定的工业应用价值.但由于其多样性、调控机理的复杂性，再加上从自然界中分离到的酶活性不是太高，因此，距离工业应用的要求还有一定距离.今后应进一步加强对几丁质酶及壳聚糖酶的基础理论研究，并利用现代生物学技术对现有的几丁质酶及壳聚糖酶进行定向改造或筛选出新的活性更强的几丁质酶，以适应工业化生产的需要.

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antimicrobial activity

Activity of Extracellular Enzyme from Different Species of Mushroom Waste Media

GUAN Li-jie， TIAN Lu

(Shenyang University of Chemical Technology, Shenyang 110142, China)

This experiment extracted chitinase and chitosanase from 9 species of mushroom waste media and then determined their enzyme activity.The research showed that the chitinase activity of waste medium of Pleurotus ostreatus could reach to 33 U/g waste medium,which was the best;the chitosanase activity of waste medium of Flammulina velutipes could reach to 21.062 U/g waste medium,which was the best.According to the result,3 species of mushroom waste media whose chitinase and chitosanase activity were higher were screened to assay their antimicrobial activity.The research showed that this 3 species of crude extract of chitinase and chitosanase from waste medium all had inhibitory activity against Bacillus cereus,Clavibacter michiganensis subsp.michiganensis and Bacillus megaterium,which was the best.

mushroom waste medium； chitinase； chitosanase； determination of enzyme activity；

2013-11-06

关丽杰(1968-)，女(满族)，辽宁沈阳人，副教授，博士，主要从事生物农药及植物病理学的研究.

2095-2198(2015)02-0118-05

10.3969/j.issn.2095-2198.2015.02.005

Q556+.2

A