白娟 乔建军 方红

人乳头瘤病毒感染与机体固有免疫反应

白娟 乔建军 方红

人乳头瘤病毒可引起多种疾病，如寻常疣、扁平疣、尖锐湿疣、鲍恩样丘疹病、宫颈癌等。人乳头瘤病毒可以有效地逃逸固有免疫识别，其可能原因包括嗜上皮性、非溶解性复制、高免疫原性的衣壳蛋白在免疫活跃的复层鳞状上皮基底层呈低水平表达等。人乳头瘤病毒的致癌性以及所致疾病的临床高发病率受到人们的广泛关注。机体对抗人乳头瘤病毒的固有免疫已成为研究热点。概述多种皮肤免疫细胞，如角质形成细胞、树突细胞、朗格汉斯细胞、浆细胞样树突细胞、自然杀伤细胞和恒定型自然杀伤T细胞对人乳头瘤病毒固有免疫反应的相关研究。

人乳头瘤病毒；免疫学；逃逸反应；角蛋白细胞；树突细胞；郎格尔汉斯细胞；Toll样受体

1 概述

人乳头瘤病毒（HPV）是一类无包膜的双链DNA病毒。目前从临床皮损中已分离出至少180种基因型［1］。根据主要衣壳蛋白L1的DNA序列分为α、β、γ、μ、ν5 个属。根据潜在致癌性的不同再分为低危型（良性皮损）和高危型（癌前或恶性皮损）。两种分类间无明确的对应关系，但相同种属的病毒有类似的生物学或病理学特性。α属包括低危型如α4（HPV2、27、57），α10（HPV6、11、13、44、74）；高危型如 α7（HPV18、39、45、59、68、70），α9（HPV16、31、33、35、52、58、67）。β 属通常与疣状表皮发育不良和免疫缺陷个体的皮损相关。γ和μ属多引起良性皮损。HPV的基因由3个区组成：早期区（E）编码6种非结构蛋白，为E1～ 2、E4～7；晚期区（L）编码2个结构蛋白，为主要衣壳蛋白（L1）和次要衣壳蛋白（L2）；以及不编码的上游调节区（URR）。E1、E2、E4和E5蛋白是病毒DNA复制所需要的。E2编码的蛋白除在病毒复制中发挥辅助作用外，还在病毒早期基因转录水平发挥调节作用，是病毒基因表达的负性调节因子。高危型HPV E6和E7蛋白为致癌蛋白。E6蛋白与p53结合并使之泛素化，从而破坏了细胞凋亡机制；E7蛋白结合未磷酸化的视网膜母细胞瘤蛋白，跨越细胞循环的G1/S检测点。E6和E7蛋白共同作用使感染细胞发生改变并永生化。而低危型HPV相应的蛋白无此功能。L1和L2蛋白是构成HPV病毒粒子和病毒样粒子所必需的［1-2］。

HPV对皮肤及黏膜上皮细胞有高度亲嗜性。病毒首先感染与基底膜毗邻的未分化有增殖能力的基底层角质形成细胞（KC）。病毒感染和增殖完全依赖于KC的分化和表达。病毒感染细胞到病毒释放大约需要3周，这与基底KC向上迁移通过表皮并完全分化和脱屑所需的时间较一致。病毒基因高水平表达病毒蛋白产物和病毒聚集通常出现于棘细胞上层以及颗粒层［1-2］。

HPV感染可以引起多种疾病，包括寻常疣、跖疣、扁平疣、疣状表皮发育不良、尖锐湿疣、鲍恩样丘疹病以及非特异性表皮内新生物等。致癌HPV感染还可引起宫颈癌、外阴和阴道肿瘤、鲍恩病、肛门癌、阴茎癌、头颈癌、喉乳头瘤、结膜乳头状瘤和复发性乳头瘤等［3］。

2 HPV的免疫逃逸机制

HPV病毒感染至皮损出现的时间变化很大，从几周到几个月不等，提示HPV可能有效地逃逸宿主的免疫系统。

HPV的表达和复制局限于鳞状上皮细胞，不感染抗原提呈细胞。而且，HPV感染、复制和装配不引起KC溶解和病理性死亡，病毒粒子从皮肤脱落而非释放，使其远离宿主免疫监视，抗原提呈细胞没有机会吞噬病毒。分化的KC发生凋亡，因此，负载病毒的KC死于“自然原因”。这样，HPV感染并不引起炎症，抗原提呈细胞活化和迁移至局部所需的促炎症因子几乎没有或很少产生，导致没有明显的“危险信号”向免疫细胞警报病毒的存在，宿主可以长期保持对病原体未知的状态，这可能是导致慢性持续感染的主要原因［1-3］。

另一个逃逸机制是病毒基因表达的严格控制。由于HPV E6、E7蛋白和高免疫原性的病毒粒子仅在表皮棘细胞上层及颗粒层呈高表达，而在免疫活跃的复层鳞状上皮基底层呈低水平表达，使得朗格汉斯细胞（LC）无法充分活化［4］。另外，HPV可以减少和推迟衣壳蛋白的表达，可能是由于不同种属中同一氨基酸的偏好密码子不同。HPV优先利用的密码子哺乳动物很少使用，故在基底上皮细胞中HPV的衣壳蛋白由于相一致的tRNA的可用性受限而表达减少［5］。

总之，HPV的嗜上皮性、非溶解性复制、严格的程序性表达以及密码子的优先选择使感染的皮肤或黏膜局部免疫细胞无反应性，有效地逃逸宿主固有免疫反应，延迟适应性免疫细胞的活化。

3 HPV与固有免疫反应

HPV感染的早期阶段，宿主固有免疫反应成为防御感染的第一道防线。KC、树突细胞（DC）、LC、浆细胞样DC、自然杀伤细胞（NK细胞）和恒定型自然杀伤T细胞（iNKT细胞）等参与了固有免疫反应［5-8］。

3.1 KC：具有免疫功能，但不是经典的免疫细胞。可作为非专业的抗原提呈细胞发挥作用，提呈MHCⅠ类分子相关肽，并适量表达MHCⅡ。KC还能分泌促炎症细胞因子和趋化因子，并诱导Th1和Th2型细胞因子的表达，诱导CD4+T细胞活化成为功能性的细胞因子分泌细胞，使CD8+记忆性T细胞转化为细胞毒状态［9］。

女性阴道上皮细胞表达多种Toll样受体（TLR），分布于细胞表面（TLR 1～2、4～6）或位于核内体（TLR3和TLR9），可以帮助KC成为对抗病原微生物的第一效应器。通过双链RNA激发TLR3诱导TLR7表达，活化干扰素反应基因，产生Ⅰ型干扰素［1，3］。

HPV感染可以改变KC的细胞因子水平，导致细胞产生炎症反应的能力下降。HPV感染组织的微环境中转化生长因子β1和β2、基质金属蛋白酶2和9、白细胞介素（IL）17和10上调；E钙黏素、干扰素调节因子-1和3、巨噬细胞炎症蛋白3（CCL20），TLR9 表达减少［7］。

E钙黏素为Ⅰ型经典钙黏蛋白，通常表达于KC和LC表面，并介导二者间的黏附，使LC停留在表皮。HPVα4、α7、α9和 γ、μ 属感染引起 KC 中 E 钙黏素表达减少，限制了KC和LC的黏附，使表皮中的LC减少［4］。研究显示，HPV16 E6表达的细胞中DNA甲基转移酶活性增加，E钙黏素的转录受到抑制，细胞表面E钙黏素表达减少。使用DNA甲基转移酶抑制剂可恢复E钙黏素的转录和细胞表面的蛋白水平［10］。

CCL20是最有效的趋化因子，诱导未成熟LC浸润到鳞状上皮。体外实验显示，HPV16 E6和E7蛋白使感染的KC分泌CCL20减少。Nakayama等［11］研究显示，非炎症性疣体皮损中CCL20表达水平下调，炎症性疣体的KC中CCL20上调，并随后募集不同的DC亚型和细胞毒T细胞，以利疣体清除。

3.2 DC和LC：LC是表皮内唯一的CD207+专职抗原提呈细胞，是启动适应性免疫对抗感染的重要哨兵［8］。病毒衣壳摄入是DC常见的活化信号，但有证据表明，LC不能像真皮DC一样通过摄取HPV衣壳而活化，从而导致LC的迁移和成熟受到抑制［4］。另外，HPV衣壳蛋白直接抑制LC抗原提呈，导致LC活化延迟，无法针对衣壳蛋白产生充分的免疫反应［6］。HPV调节宿主抗原提呈细胞的黏附和迁移。E6和E7蛋白下调E钙黏素和CCL20，干扰了KC与LC黏附以及未成熟LC浸润到表皮。低危或高危型HPV感染后（除了β型），感染部位LC的数量显著减少，这可能是HPV持续存在的一个重要因素。此外，有证据支持HPV感染皮损中剩余的LC对于皮肤中效应记忆T细胞的活化有缺陷［12］。

3.3 浆细胞样DC：浆细胞样DC通过产生Ⅰ型干扰素（IFN-α、β）参与抗病毒固有免疫反应，并可建立固有和适应性免疫间的桥梁。高危型HPV相关的上皮内瘤变皮损中，浆细胞样DC浸润表皮和真皮全层，且数量较健康人显著增加［13］。体外研究表明，HPV16病毒样粒子可诱导浆细胞样DC分泌IFN-α、IL-16以及肿瘤坏死因子 α 和IL-8［14］。

免疫调节剂咪喹莫特的作用是通过增加促炎症细胞因子和趋化因子的表达来诱导局部炎症反应。这些炎症因子可能随后刺激局部pDC行使效应，在控制HPV感染中起着重要作用［3］。

3.4 NK细胞：NK细胞表达IFN-γ，颗粒酶和穿孔素。其活化依赖于Ⅰ型IFN和促炎症细胞因子，例如IL-12和IL-18。活化之后，通过颗粒酶和穿孔素发挥细胞毒性［8］。

研究显示，高危型HPV感染的上皮内瘤变皮损的真皮有少量NK细胞，主要位于基底层细胞周围。真皮少量的NK细胞直接接触感染的KC可能是控制HPV感染的一个重要因素。HPV感染后，感染部位的真皮层NK细胞数量比正常皮肤高出2倍以上，与固有免疫活化相一致，可能有助于启动CD8+T细胞的抗病毒感染［13］。

E7癌蛋白抑制MHCⅠ加工和处理途径的成分TAP1和LMP2以及MHCⅠ重链，导致HPV感染的细胞表面MHCⅠ表达减少。siRNA敲除E7后恢复了HPV转染细胞的MHCⅠ表达［8］。而且，NK细胞可能还通过其他方式对HPV缺乏反应。NK细胞可以与抗原提呈细胞相互作用，从而获得MHCⅡ分子，使得抗原提呈中缺乏共刺激而抑制CD4细胞［15］。

但体外研究显示，HPV16 E7可以增强体外扩增的NK细胞对宫颈癌细胞或HPV16感染细胞的细胞毒性，提示NK细胞可能用于宫颈HPV感染的免疫治疗［16］。

3.5 iNKT细胞：是CD1d限制性T细胞，表达αβT细胞抗原受体，在固有免疫中可能有助于清除HPV感染。iNKT细胞通常不存在于正常表皮，但可以在一些病理状态下（如HPV感染时）浸润到皮肤［8］。受到刺激后，iNKT细胞快速分泌大量细胞因子，包括IFN-γ、TNF、IL-4、L-10 和 IL-3［7］。

HPV E5蛋白影响CD1d转录后水平。在内质网，HPV E5与钙连接蛋白相互作用，CD1d的修饰被阻断，错误折叠的CD1d转移至胞质和细胞的蛋白酶体降解，CD1d表达减少。蛋白酶体抑制剂治疗可以使CD1d表达恢复。HPV E6表达细胞的CD1d表达减少可能使HPV逃避感染早期阶段的保护性免疫监视［17］。

3.6 TLR：是一个免疫受体家族，人类表达该家族10个成员（TLR1～10），在各种免疫细胞包括巨噬细胞、DC、B细胞和特异性T细胞均有表达。TLR属于模式识别受体，识别病原体相关分子模式并与之结合，激活固有免疫，也是病毒感染期间连接固有和适应性免疫的桥梁。TLR不仅表达于细胞表面，而且也存在于细胞内囊泡例如核内体或溶酶体和内质网［18］。核内体TLR在抗病毒感染，中和病毒核酸中发挥重要的作用。

人体的物理屏障受损后，HPV的病原体相关模式分子结合广泛分布于各种免疫和非免疫细胞的宿主模式识别受体如TLR，活化下游的信号通路，将免疫反应的多个方面联系起来，包括DC、巨噬细胞和NK细胞活化，核因子κB和促分裂原活化蛋白活化，促炎细胞因子的表达和适应性免疫的诱导［18］。HPV的病原体相关模式分子包括L1和L2蛋白组成的衣壳和8 kb双链环形DNA基因［8］。与双链DNA病毒感染相关的TLR主要为TLR9。TLR9可诱导促炎症基因的表达，是病毒感染诱导免疫反应所必需的。

在体外，HPV16 E6和E7表达可抑制TLR9转录，导致TLR9信号转导通路功能丧失。用TLR9配体刺激表达E6/E7的KC，CCL20和IL-8的产生受到抑制。有趣的是，低危型HPV的E6和E7蛋白不能下调TLR9启动子，表明TLR9的调节是高危型HPV 所特有的［18］。

4 结语

高危型HPV可致尖锐湿疣、多种皮肤肿瘤以及宫颈癌，后者是全世界女性高发病率和死亡率的主要原因，机体对HPV固有免疫反应涉及上述多种免疫细胞及细胞因子。尽管其确切机制仍不十分清楚，但临床上应用的一些药物包括IFN-α、咪喹莫特等，具有促进机体固有免疫反应，治疗生殖器疣取得了一定的疗效。相信随着人们对HPV感染的病理机制及机体对抗HPV的免疫反应的进一步深入研究，将全面揭示HPV感染局部的微环境和相关分子机制，从而开发更有效的清除病毒的新的治疗方法，达到防控HPV所致各种疣及相关恶性肿瘤的目的。

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Human papillomavirus infection and host innate immune responses

Bai Juan,Qiao Jianjun,Fang Hong.Department of Dermatology,First Affiliated Hospital,Zhejiang University School of Medicine,Hangzhou 310003,China

Human papillomavirus （HPV） can cause a variety of diseases,such as verruca vulgaris,verruca plana,condyloma acuminatum,bowenoid papulosis,cervical cancer,and so on.Moreover,HPV can efficiently escape from the recognization by innate immune system,which may be attributed to epithelial tropism,non-lytic replication,and low expression of capsid protein with high immunogenicity in the basal lamina of immunoactive stratified squamous epithelium.The carcinogenicity of HPV and high incidence of HPV-related diseases have

extensive attention.The innate immunity against HPV infection has become a research hotspot.In this review,the authors summarize multiple dermal immune cells involved in the innate immunity against HPV,including keratinocytes,dendritic cells,Langerhans cells,plasmacytoid dendritic cells,natural killer cells and invariant natural killer T cells.

Human papillomavirus;Immunology;Escape reaction;Keratinocytes;Dendritic cells;Langerhans cells;Toll-like receptors

Fang Hong,Email:fanghongzy@sina.com

10.3760/cma.j.issn.1673-4173.2015.02.022

2010年中国医师协会皮肤科医师分会—复旦张江光动力研究基金

310003杭州，浙江大学医学院附属第一医院皮肤科

方红，Email:fanghongzy@sina.com

本文主要缩写：HPV：人乳头瘤病毒，KC：角质形成细胞，LC：朗格汉斯细胞，DC：树突细胞，pDC：浆细胞样树突细胞，NK：自然杀伤细胞，iNKT：恒定型自然杀伤T细胞，TLR：Toll样受体，IL：白细胞介素，CCL20：巨噬细胞炎症蛋白3

2014-05-09）