柳琦 张汝芝

回复镶嵌现象与隐性营养不良型大疱性表皮松解症治疗的研究进展

柳琦 张汝芝

隐性营养不良型大疱性表皮松解症是一种遗传性水疱病，由编码Ⅶ型胶原的基因突变引起，对患者生活质量有很大影响，目前治疗多为对症处理，迫切需要更好的治疗方法。近年研究发现，隐性营养不良型大疱性表皮松解症患者存在回复突变所致的片状外观正常皮肤。这种现象称为回复镶嵌现象，也称为天然基因治疗。这一发现开启了回复细胞治疗的可能性，即回复的角质形成细胞体外培养移植到受损皮肤。假如结合患者特异性诱导性多能干细胞方法，可以有机会培养出大片健康皮肤移植物。另外，回复体来源的诱导性多能干细胞还可以分化为造血细胞和间质干细胞，骨髓移植后归巢到水疱区域，即“从皮肤到血细胞，再修复皮肤”。

营养不良性大疱性表皮松解；皮肤疾病，水疱大疱性；镶嵌现象；遗传现象；多能干细胞；治疗应用

隐性营养不良型大疱性表皮松解症（RDEB）是一种少见的常染色体隐性遗传性皮肤病，其发生是由于编码Ⅶ型胶原（Col17）的基因突变。Col17是基底膜带处固着性原纤维的主要成分，而固着性原纤维参与表皮和其下真皮的黏附，使得皮肤功能完整。Col17的缺乏使得皮肤脆弱、水疱形成和糜烂［1］。因此，RDEB患者的皮肤和口腔、胃肠道、泌尿生殖道黏膜反复发生水疱，最终，水疱愈合留下瘢痕，导致严重的畸形。如果继发感染，可导致败血症或多器官衰竭。转移性鳞状细胞癌是RDEB患者最常见的死亡原因。目前，RDEB的治疗主要是对症治疗和创伤护理，如止痛包扎、营养支持和抗感染等。临床研究发现，RDEB患者存在从未发生水疱的皮肤，这些皮肤中存在回复体（revertant）细胞，这些细胞有自发性矫正的 Col17A1 基因，并表达 Col17［2］。

1 回复体及回复镶嵌现象

1.1 回复体：回复体来自拉丁语revertere，意味着回到原来的状态，是一种躯体细胞内致病突变的自发性矫正。发生机制包括逆突变（back mutation）、基因转换、基因内重组和第二位点突变等［3］。逆突变指致病突变变成野生型序列，恢复了野生型蛋白质的翻译。逆突变是随机的，可能是基因的不稳定性导致突变率增加，或者受环境因素的影响，如长期暴露于紫外线。基因转换指遗传物质从供体序列到高度同源的受体序列的转移，单向而非相互，导致受体序列部分或全部被供体序列替换，而供体序列保持不变。基因内重组涉及遗传物质在供体和受体间相互转移，导致其中一个子代细胞携带源于亲代的两种致病突变，而另一个回复性子代细胞不携带致病突变［4］。第二位点突变是一种自发补偿性突变，发生在致病移码的上游或下游，从而恢复阅读框，产生的蛋白质类似于野生型或者尽管有功能但与野生型相比略有不同［5］。其他回复体机制还包括反转录转座子和DNA滑动。回复可以发生在生殖细胞或体细胞内，若发生在生殖细胞内，则可以传递给子代。

1.2 回复镶嵌现象（revertant mosaicism，RM）：RM是指携带种系突变的细胞和已经矫正种系突变的回复细胞共存。最初认为RM是一种罕见的现象，但最近研究表明，RM并不少见。尽管RM首次在RDEB患者身上发现，但并不是RDEB所特有的，在其他疾病中亦可见，如原发性免疫缺陷病、范可尼贫血、鱼鳞病、杜氏肌营养不良症和酪氨酸血症等［6］。据报道，Wiskott-Aldrich综合征中RM的发生率达11%（30/272例），范可尼贫血中达18% （5/28例），非Herlitz交界性大疱性表皮松解症（JEB-nH）中达35%（7/20例）［4］。RM似乎在再生器官系统的遗传性疾病中很普遍，如皮肤、肝脏和造血系统等［7］，回复细胞类型包括肝细胞、淋巴细胞、肌细胞、成纤维细胞（FB）和角质形成细胞（KC）等［5］。

2 RM在RDEB治疗中作用

2.1 RDEB治疗：RDEB尚无确定的治疗方法，只是对症处理和创伤护理，如止痛包扎、营养支持和抗感染等。随着对RDEB发病机制及遗传基因等方面的深入研究，在治疗方面已取得了重大进展，包括基因治疗（载体介导、基因重编程和基因沉默）、蛋白替代疗法、细胞治疗（系统应用骨髓干细胞移植、间充质干细胞、局部应用KC和FB、培养/移植回复性细胞）以及应用诱导性多能干细胞（iPSC）等［8］。虽然这些治疗为患者带来了希望，但大部分仍存在许多亟待解决的问题，如病毒或非病毒介导的基因治疗可能导致插入性突变或致癌作用，蛋白疗法或异体细胞治疗可能引起免疫排斥反应等［9］。

1例36岁非Herlitz交界性大疱性表皮松解症患者被成功移植LAMB3 cDNA（反转录病毒携带）修正的表皮片，并维持功能性表皮，显示遗传性皮肤病体外基因治疗的可行性，但该方法的安全性有待考证［10］。由于不能识别和靶向干细胞（能重建皮肤所有组分），基因导入效率低下，因此，基因矫正治疗遗传性皮肤病面临很大困难。

2.2 皮肤RM的首次发现：首次报告的皮肤RM出现在28岁泛发性萎缩性良性大疱性表皮松解的女性患者，该报道首次表明了在遗传性疾病中体细胞基因转换的作用。此例患者有两个COL17A1突变的复合杂合子，即母系遗传的移码突变c.1706delA和父系遗传的无义突变p.Arg1226X。临床上出现多片外观正常的皮肤，对称性分布于上肢的伸侧。受累皮肤内未检测到Ⅶ型胶原，但在回复皮肤中，荧光显微镜观察到Ⅶ型胶原的镶嵌型。从回复体细胞提取DNA，进行序列分析，显示父系遗传的突变，但不存在母系遗传的突变，提示这些KC中的逆突变抵消了母系突变［11］。

2.3 回复体细胞移植治疗 RDEB：Gostynski等［12］利用胶带剥离法成功治疗1例镶嵌性Ⅶ胶原缺陷的JEB-nH患者。活检获取患者左腕部表型正常的含回复体细胞的皮肤，胰酶消化获得KC，接种于饲养层细胞上，5周后获得所需移植细胞片。作为受皮区的右股部，乙醚脱脂后，用聚丙烯酸脂胶带粘贴，然后轻轻撕去粘有表皮的胶带，露出无血的创面裸露的致密板，整个操作要求无菌。此方法简单有效、耐受性强、无痛。移植后4个月后随访，移植区上皮化，无瘢痕，有轻度线状色素沉着，显示移植成功，然而，因移植物中存留的回复体细胞少于3%，因此没有达到功能性修复。

2.4 回复体细胞移植的局限性：研究表明，人们可以利用RM中的回复体细胞治疗遗传性水疱性皮肤病的创面，但是，由于以下可能的原因导致移植物中回复性细胞比例较低：①高度增殖的回复体细胞可能在RM中被逐渐耗竭；②分离出回复体细胞仅能有限传代，即衍生的细胞数有限；③通常皮肤黏膜创伤不容易获得，故局部创伤治疗不能提供理想的治疗方法［13］。因此，为解决这些问题，人们推测，可以通过体外建立稳定的干细胞来源，以分化为目标KC，用于基因校正以达到治疗此病的目的。

3 RM结合iPSC技术治疗RDEB

RM结合iPSC技术治疗RDEB，是一种新思路。将RDEB患者的回复性细胞重编程为基因矫正的iPSC，然后将这种回复性iPSC分化成目标细胞，产生皮肤类似物用于RDEB自身的全身或局部治疗，可能降低RDEB患者的并发症、提高生存期和改善生活质量等。

3.1 患者特异性iPSC的研究现状：Itoh等［14］从2例RDEB男患儿（年龄分别为13个月和1.5岁）的正常皮肤的真皮获取FB，原代培养后，用c-MYC、SOX2、OCT4和KLF4因子转导，产生患者特异性iPSC（PS-iPSC），对PS-iPSC进行突变和指纹分析后，体外分化培养，获得KC，成功构建了三维皮肤类似物。作者的研究还显示，这些PS-iPSC分化的FB也能产生Col17，提示FB也可作为治疗RDEB的细胞来源之一［15］。既然 FB和 KC均能分泌Col17，意味着这两种细胞的表型似乎都与RDEB发病有关。Tolar等［16］从3例RDEB患者的正常皮肤中获取FB和KC，并成功重编程为PS-iPSC，这些细胞肌内注射给免疫缺陷鼠，可生成畸胎瘤；体外可分化成造血细胞；用包含人Col17A1基因的质粒转染该PS-iPSC，可获得基因修正。

3.2 PS-iPSC的潜能：PS-iPSC的获取使得人们更好地理解在上皮干细胞、祖细胞及其子代细胞发育中，Col17缺陷引发的下游事件。RDEB患者皮肤FB和KC来源的PS-iPSC体外可分化成造血和非造血细胞。这些研究结果强调了RDEB来源的PS-iPSC的潜能：①RDEB来源的PS-iPSC显示疾病相关表型，提供研究RDEB和相关疾病发生机制的模型［15］，与分化的人类细胞和RDEB动物模型相比，PS-iPSC更有优越性，提供机会更深入分析Col17缺陷的细胞效应，不依赖于糜烂和水疱形成时系统炎症反应的继发效应；②使用已知基因纠正的PS-iPSC（来自RM）产生自体造血移植物，用作系统治疗；③产生皮肤细胞治疗RDEB患者皮肤和黏膜的损伤［13］。这一技术在理论上可以获得用之不竭的患者特异性回复性细胞，无需基因矫正，能够克服基因治疗、异体细胞疗法等治疗方案可能带来的弊端。

3.3 RM结合PS-iPSC应用的受限因素：RM结合PS-iPSC治疗RDEB的潜在风险与下列因素有关：①用胚胎干细胞特异性的转录因子重编程，可能有基因毒性，重编程方法使得突变基因增强（如病毒载体输入）；②获得和维持多能表型和种系特异性细胞命运的可信度；③分化的PS-iPSC子代的纯度，最少化或避免未分化和潜在致瘤iPSC的存在［16］。

4 结语

RM这一天然基因治疗为RDEB带来了曙光，但因其明显的局限性：回复性KC和干细胞数量有限，无法真正改善患者的生活质量，因此，仅凭借RM治疗RDEB仍然十分困难。随着研究的进展，人们利用尝试RM联合iPSC技术，将Col17A1回复性KC或FB诱导为功能性iPSC，然后将此功能性iPSC分化成目标细胞，并进行扩增，用于局部或全身治疗。随着对RDEB的不断深入研究和分化、移植、iPSC等技术的不断成熟，RM联合iPSC技术可能为未来治疗RDEB提供一种有前景的治疗方法。

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Revertant mosaicism and treatment of recessive dystrophic epidermolysis bullosa

Liu Qi,Zhang Ruzhi.Third Affiliated Hospital of Soochow University,Suzhou 213003,China

Recessive dystrophic epidermolysis bullosa （RDEB）,an inherited blistering disease caused by mutations in the gene encoding typeⅦ collagen,has a strong impact on patients′quality of life.At present,it is mainly managed by symptomatic treatment,and more effective therapeutic approaches are urgently needed.Recent studies have found the presence of patches of normal-looking skin caused by reverse mutations in patients with RDEB.This phenomenon is called revertant mosaicism,also known as “natural gene therapy”.This finding offers the possibility of revertant cell therapy,namely,transplantation of revertant keratinocytes culturedin vitroonto damaged skin.The combination with patient-specific induced pluripotent stem cells（iPSCs） makes it possible to harvest large sheets of healthy skin graft.Moreover,iPSCs derived from revertant keratinocytes can differentiate into hematopoietic cells and mesenchymal stem cells,which can home to blistering areas after bone marrow transplantation,namely,“from skin to blood cells,then to repair of skin”.

Epidermolysis bullosa dystrophica;Skin diseases,vesiculobullous;Mosaicism;Genetic phenomena;Multipotent stem cells;Therapeutic uses

Zhang Ruzhi,Email:zhangruzhi628@163.com

10.3760/cma.j.issn.1673-4173.2015.02.012

国家自然科学基金（81171516）

213003苏州大学附属第三医院

张汝芝,Email:zhangruzhi628@163.com

本文主要缩写：RDEB：隐性营养不良型大疱性表皮松解症，RM：回复镶嵌现象，FB：成纤维细胞，KC：角质形成细胞，iPSC：诱导性多能干细胞

2014-05-09）