刘成龙,曾晓起

(中国海洋大学,1.水产学院; 2.海洋生物多样性与进化研究所，山东 青岛 266003)



马粪海胆不同地区群体形态学比较研究*

刘成龙1，2,曾晓起1,2**

(中国海洋大学,1.水产学院; 2.海洋生物多样性与进化研究所，山东 青岛 266003)

运用单因子方差分析、主成分分析、聚类分析3种方法，对大连、威海、青岛、嵊泗和南麂5个地区的马粪海胆(Hemicentrotuspulcherrimus)群体(125只)的13个特征进行了比较分析。单因子方差分析结果显示，大连、威海、青岛地区的马粪海胆样品13组数据特征比值参数与另外2个地区的均差异显著(P<0.05)；主成分分析结果显示，贡献率最大的3种主成份的累计贡献率为75.599%；聚类分析结果显示，大连、威海和青岛地区马粪海胆聚为一支，南麂地区的马粪海胆与嵊泗地区的聚为一支；根据Mayr等提出的75%原则，大连、威海、青岛地区的马粪海胆和南麂、嵊泗地区的马粪海胆的形态差异属种内不同群体间的差异，未到亚种水平。

马粪海胆；形态学；单因子方差分析；主成分分析；聚类分析

马粪海胆(Hemicentrotuspulcherrimus)隶属于拱齿目 (Camarodonta)、球海胆科 (Strongylocentrotidae)、马粪海胆属 (Hemicentrotus)，为我国和日本特有种，黄、渤海沿岸极为普遍，向南可到浙江和福建沿海[1]。

形态学比较研究法，又称生物学测定方法，属于传统种群鉴别方法，是物种分类的基本方法之一，也是早期经典遗传学研究物种遗传变异的主要方法[2-4]。长期以来，物种分类、资源评价、物种起源和进化研究都是以形态标记为基本指标，到目前为止，形态指标依然是分类学研究的常用方法，并且已经得到了广泛的应用[5-7]。 目前， 对海胆的研究主要集中于生物学、繁殖习性和细胞遗传学等方面，在海胆的形态学分析上，张文峰进行了3种刻肋海胆分类的数量分析，利用形态学比较研究法对3种刻肋海胆形态学差异及分类关系做了研究，然而对于不同地域的马粪海胆群体的形态学差异的研究尚未见报道[8-11]。

本研究对中国从北到南5个地区的马粪海胆群体进行收集和形态学特征测量，结合统计比较方法，分析比较了这5个群体马粪海胆的形态学差异。研究结果将为马粪海胆的种群划分及生物学研究提供基本资料，同时也为其群体遗传学研究提供形态学依据。

1 材料和方法

1.1 实验材料

马粪海胆样品于2010年8月～2012年8月分别采自大连黑石礁、威海小石岛、舟山嵊泗列岛、温州南麂列岛和青岛大公岛，并依次缩写为DL、WH、SS、NJ、QN以便后文表述(见图1，表1)。样品用5%的NaoH溶液煮沸，去表面棘保存备用。

图1 马粪海胆样品采集地点Fig.1 sampling locations of Hemicentrotus pulcherrimus

1.2 实验方法

1.2.1 形态学特征 本研究测定了13个量度特征：1：壳长，2：壳宽，3：壳高，4：口径，5：步带(赤道部)宽，6：间步带(赤道部)宽，7：顶系长，8：顶系宽，9：围肛部长，10：围肛部宽，11：筛板宽，12：第5生殖板宽，13：第Ⅱ终板宽(见图2)。

1.2.2 测量方案 测量壳体特征1～6采用游标卡尺度量，精确度0.01mm；顶系7～13采用连于Nikon SMZ8000型解剖镜的Nikon DN100数码相机拍照，用图像分析软件PHOTO SHOP cs4放大后按比例分析度量。

表1 样品基本信息Table1 The basic information of samples

图2 海胆量度特征图示[11]Fig.2 Measurement of sea urchin body

1.3 数据处理

1.3.1 数据的标准化 为了消除因个体大小导致的形态学参数影响，将13组量度特征数值两两组合求其相互关系，参照李思发等的方法[12-13]，将测量数据转化成对壳长的比值，故本研究将测得的13组形态学参数分别除以壳长进行标准化，得出12组量度比值数据(以A～L表示)。A：壳宽/壳长，B：壳高/壳长，C：口径/壳长，D：步带(赤道部)/壳长宽，E：间步带(赤道部)宽/壳长，F：顶系长/壳长，G：顶系宽/壳长，H：围肛部长/壳长，I：围肛部宽/壳长，J：筛板宽/壳长，K：第5生殖板宽/壳长，L：第Ⅱ终板宽/壳长。

1.3.2 数据分析 运用软件Excel 2007和SPSS19.0对以上12组标准化数据进行一下统计分析。

(1)主成分分析：运用SPSS19.0计算各主成分负荷值和贡献率，并绘制城主成份散布图。

(2)聚类分析：运用Excel 2007计算出5地区海胆12组数据的参数平均值，运用SPSS19.0的Square Euclidean距离和类间平局连锁(Between-groups linkage)模型进行相似性聚类分析，并构建聚类树。

(3)单因子方差分析(one-way ANOVA):运用Excel2007对数据录入并进行标准化，将录入数据导入SPSS19.0进行单因子方差分析，并进行多重比较。对符合方差齐性的量度特征采用LSD法，不符合方差齐性的数据采用Tamhane’s T2法。

(4) 差异性系数分析: 参照Mayr等提出的75 %识别与划分的规则[14]。

用Mayr 差异系数公式来计算几个群体对应性状的差异程度的量化数值,并用C.D> 1.28 亚种差异标准来衡量几个群体之间的差异程度。

2 结果与分析

2.1 主成份分析

贡献率最大的主成分共计3项，累计贡献率为75.60%(见表2)。其中，第1主成分贡献率为46.616%，主要由F、G、J、K、H、L、E决定；第2主成分贡献率为20.611%，主要由C、B、A组成；第3主成分贡献率8.371%，主要由I决定。除此之外其余主成分贡献率均较低。第1主成分主要反映了顶系结构的差异，第2主成分反映了壳形的差异，第3主成分主要反映了围肛部的差异。

根据前3个主成分绘制主成分分析图(见图3)，从图中可以看出，除青岛群体外，其他4个群体马粪海胆第1主成分上明显分为2个组群，大连、威海马粪海胆聚为一组，南麂、嵊泗马粪海胆聚为一组。第2主成分也基本将这4组海胆区分开。将青岛群体加入后，可见在第1主成分上，青岛地区马粪海胆与大连、威海地区马粪海胆更为接近，但在第2主成分上青岛地区马粪海胆与其他4种马粪海胆没有明显分别。

图3 马粪海胆形态参数前3个主成分分布图Fig.3 Plot of first three principal components from PCA based on morphological characters of H.pulcherrimus species

表2 5个马粪海胆群体的形态参数主成分分析的因子载荷值Table 2 Factor loadings of principal components extracted from morphological parameters of 5 groups H. pulcherrimu

Note:①Width of the test/Length of the test；②Height of the test/Length of the test；③Diameter of the peristome/Length of the test；④Maximum width of the ambulacrum/Length of the test；⑤Maximum width of the interambulacrum/Length of the test；⑥Length of the apical system/Length of the test；⑦Width of the madreporite/Length of the test；⑧Length of the periproct/Length of the test；⑨Width of the periproct/Length of the test；⑩Width of the madreporite/Length of the test；Width of genital plate 5/Length of the test；Width of ocular plate Ⅱ/Length of the test；Contributions ratio；Cumulative contribution ratio

2.2 聚类分析

运用SPSS软件中的block距离和Between-groups linkage方法对变量间的相似性进行聚类分析，构建的聚类数如图4所示，结果表明5个群体可分为2支，大连、威海和青岛的马粪海胆聚为一支，南麂与嵊泗的马粪海胆聚为一支，其中青岛的马粪海胆与大连威海的又有所差异。

图4 马粪海胆13组形态参数平均值聚类树Fig.4 Dendrogram of cluster based on means of morphometric character for H. pulcherrimus species

2.3 单因子方差分析

通过单因子方差分析显示(见表3)，大连、威海、青岛地区马粪海胆的12组形态学参数与南麂、嵊泗地区差异性显著(P<0.05)；其中大连与威海的形态学参数差异不显著；大连与青岛的样品有4组差异显著(P<0.05)(分别是F、G、K、L)；大连与南麂的样品有7组数据差异显著(P<0.05)(分别是B、F、G、H、I、K、L)；大连与嵊泗的样品有8组数据差异显著(P<0.05)(分别是B、F、G、H、I、J、K、L)；威海与青岛的样品有4组数据差异显著(P<0.05)(分别是F、G、K、L)威海与南麂的样品有9组数据差异显著(P<0.05)(分别是：B、C、F、G、H、I、J、K、L)；威海与嵊泗的样品参数有8组数据差异显著(P<0.05)(分别是B、F、G、H、I、J、K、L)；青岛与南麂的样品有7组数据差异显著(P<0.05)(分别是B、F、G、H、I、K、L)；青岛与嵊泗的样品有6种数据差异显著(P<0.05)(分别是B、H、I、J、K、L)南麂与嵊泗的样品数据有3组差异显著(P<0.05)(分别是F、G、J)。

2.4 差异系数(C.D)

参照Mayr 等提出的75 %识别与划分的规则,差异系数由下面公式求得:

C.D= ︱M1 -M2 ︱/(S1 +S2 )

式中:M1,M2 和S1,S2 分别对应于两群体性状的平均值和标准差。通过计算得出表4中的数据。

表3 5个马粪海胆群体的12组形态参数的单因子方差分析(平均值±标准差，P<0.05)Table 3 One-wayANOVA for 12 morphometric parameter rs of 5 H. pulcherrimus species(mean±SD，P<0.05)

注：英文字母上标表示群体间差异程度，上标相同或包含关系表示差异不显著，上标不同或交集关系表示差异显著。Note: The superscript means the different among populations. The same superscripts or containing relation mean the differences are not significant; different superscript or intersection relation mean the differences are significant.

①Width of the test/Length of the test;②Height of the test/Length of the test;③Diameter of the peristome/Length of the test;④Maximum width of the ambulacrum/Length of the test;⑤Maximum width of the interambulacrum/Length of the test;⑥Length of the apical system/Length of the test;⑦Width of the apical system/Length of the test;⑧Length of the periproct/Length of the test;⑨Width of the periproct/Length of the test;⑩Width of the madreporite/Length of the test;Width of genital plate 5/Length of the test;Width of ocular plate Ⅱ/Length of the test

表4 不同群体形态特征的差异系数(C.D) 值Table 4 Coefficients of difference between the morphological characteristics of two populations for different pairs

3 讨论

3.1 主成分分析和聚类分析结果

主成分分析是一种将原来多个彼此相关的指标转换为新的、个数较少且相互独立或不相关的综合指标的方法，这种方法作为一种多变量分析方式，迄今为止已经成功运用于新物种的发现和确认中，该方法能够直观地反映各个体之间的相似程度[15-16]。由主成分分析结果可以看出5个地区所有样本12个形态学指标可以归纳为3个主成分，累计贡献率为75.599%，其中第1主成分荷载量达到46.616%。通过进一步分析可得，第1主成分由海胆顶系各测量数据组成，第2主成分主要由壳体各测量数据组成，这一结果也反映了主成份分析降维的数据处理方法。除嵊泗外其他四地的样本在第1主成分和第2主成分上分散程度相当，不同地理群体样本间能够形成相对集中的组，说明2个地理群体已经产生一定程度的分化，分化主要体现在顶系结构上。

聚类分析是采用群体各个变量平均值来总体反映各群体之间相似性的分析方法[17]。通过聚类分析得出的结果可知，马粪海胆的形态在不同采集地点的地理分布上产生了相似性聚类，这种聚类结果呈现出南北种分化的趋势，聚类分析作为最直接反映群体相似性的分析方法，其分析结果表明北方黄渤海近岸地区马粪海胆与东海近岸马粪海胆形态上产生了分化，而海胆作为一种运动能力较弱的海洋无脊椎生物，这种差异可能与海区生境的长期不同导致。

3.2 单因子方差分析和差异系数

单因子方差分析(one-way ANOVA)是一种定性的统计方法，用来检测单一因素影响的几个彼此独立的组是否来自正态分布的整体[18]。本实验样品采集均来自独立的正态分布群体，所以适合单因子方差分析。分析结果显示：大连和威海地区的马粪海胆差异性不显著(P>0.05)，南麂和嵊泗地区的马粪海胆仅有4项形态学参数存在显著差异(P<0.05)；大连、威海地区的马粪海胆较之南麂、嵊泗地区的海胆样品均有7～9 项形态学参数存在显著差异(P<0.05)。在P<0.05的水平下12种形态学参数单因子方差分析的结果显示，5个地区的马粪海胆几乎都存在个别形态学参数的显著性差异，这表明了不同生境的马粪海胆已产生了形态上的变化。在P<0.05的水平下，越多的形态学参数显著性差异就说明形态分化的剧烈。由结果可以看出大连、威海、青岛地区的马粪海胆与南麂、嵊泗地区品种存在显著差异，这也印证了聚类分析的结果。

分类学家一般把亚种作为最小的分类单位，但Mayr认为亚种还可以进一步分为不同的地理种群，从而进一步提出了75%规则，并确定了差异系数的概念，把1.28作为亚种的分类临界值。当2个群体间形态差异系数>1.28时[19]，表明它们的差异达亚种以上水平，反之则是不同地理种群间的差异。从表3可以看出，5个群体马粪海胆的差异系数小于亚种分类的临界值1.28，因此它们之间的差异仍然是属于不同地理种群的差异，还没有上升到亚种水平。

4 结语

运用单因子方差分析、主成份分析、聚类分析3种方法，本研究对大连、威海、青岛、嵊泗和南麂地区5个马粪海胆(Hemicentrotuspulcherrimus)群体(125只)的13个特征进行了比较分析。3种方法结果显示，大连和威海的马粪海胆群体较为相似， 南麂与嵊泗的马粪海胆群体较为相似，青岛地区马粪海胆的形态特征更偏向于大连威海马粪海胆。不同地域的马粪海胆群体表现出了较明显的南北差异，且差异主要集中在顶系结构上。根据Mayr等提出的75%原则，大连、威海地区的马粪海胆和南麂嵊泗的马粪海胆的形态差异属种内不同群体间的差异，未到亚种水平[20]。

形态学分析是一种传统的物种归类方法，但形态学分析法存在较大的主观因素，对于一些个体结构区别较大的形态学参数，测量和比对误差较大[21]。不同群体的分化乃至新物种的产生可能是由于遗传变异，也可能是各种复杂的环境因素综合导致[22]，仅仅从形态上很难对其进行客观的判断，同时也很难找到变异的原因。目前只有将形态、生态指标和分子标记等结合起来，才能更准确的描述不同种的差异，才能为不同地区马粪海胆群体的分类地位提供客观依据。

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责任编辑 朱宝象

A Comparative Study on the Morphological Characteristics of Hemicentrotus Pulcherrimus from Different Populations

LIU Cheng-Long1,2, ZENG Xiao-Qi1,2

(Ocean University of China, 1. College of Fisheries; 2. Institute of Evolution & Marine Biodiversity, Qingdao 266003, China)

Thirteen morphological characteristics of 125Hemicentrotuspulcherrimusindividuals from Weihai, Dalian, Qingdao, Shengsi and Nanji were measured and analyzed with multivariate analysis and one-way ANOVA, PAC (principal component analysis) and cluster analysis. The results of multivariate analysis and one-way ANOVA showed that there are significant difference (P<0.05) among populations in thirteen morphological characteristics. PAC figured out that the contribution radio of three principal components were 46.616%, 20.611% and 8.371%, respectively, and the cumulative contribution radio was 75.599%. Cluster analysis showed that Weihai, Dalian and Qingdao populations were close in morphological relationship, and Shengsi and Nanji populations were close in morphological relationship. According to the 75% rule proposed by Mayr, there are significant differences between Weihai, Dalian, Qingdao populations and Nanji, Shengsi populations were intraspecific and between populations, less than intersubspecific difference.

Hemicentrotuspulcherrimus；Morphology；one-way ANOVA；principal component analysis；cluster analysis

中央高校基本科研业务费专项(201262037;201362023)资助

2014-03-04;

2014-06-05

刘成龙(1988-)，男，硕士生。E-mail：haidaliucl@163.com

** 通讯作者： E-mail:zengxq@ouc.edu.cn

S917

A

1672-5174(2015)04-040-06

10.16441/j.cnki.hdxb.20140037