王 震,龚玉华，钱彩娣，孙春红，王雪梅，施 瑜，周丽萍,傅行礼，邵启祥

(1.江苏省镇江市第二人民医院检验科 212000；2.江苏省镇江市第三人民医院检验科 212000；3.江苏大学医学技术学院，江苏镇江 212002)



·论 著·

5种结核杆菌检测方法的临床应用价值*

王 震1,龚玉华2，钱彩娣1，孙春红2，王雪梅2，施 瑜1，周丽萍3,傅行礼3，邵启祥3

(1.江苏省镇江市第二人民医院检验科 212000；2.江苏省镇江市第三人民医院检验科 212000；3.江苏大学医学技术学院，江苏镇江 212002)

目的 比较和分析免疫磁珠捕获联合双内标聚合酶链反应-酶联免疫吸附试验定量检测结核杆菌技术(IMC-PCR-ELISA)与其他几种结核杆菌检测法在结核病诊断中的临床应用价值。方法 以102例结核分枝杆菌痰培养阳性的患者作为阳性对照，以48例结核分枝杆菌培养阴性的非结核普通住院患者作为阴性对照。比较抗酸染色涂片法(AFS)、免疫磁珠-抗酸染色涂片法(IMC-AFS)、金标抗结核抗体检测法(DICA)、普通PCR及IMC-PCR-ELISA的敏感性及特异性。结果 IMC-PCR-ELISA定量检测结核分枝杆菌全过程约4.5 h,最低检测限为5 copy/μL，本法的特异性和敏感性均为100.00%，其他4种(AFS、IMC-AFS、DICA、普通PCR)检测方法的敏感性分别为35.29%、43.14%、60.78%、93.14%，特异性分别为95.83%、95.83%、75.00%、91.67%。结论 IMC-PCR-ELISA与AFS、IMC-AFS、DICA及普通PCR相比，具有快速、灵敏、特异、可定量的特点，是临床快速诊断结核病的有效检测方法。

结核分枝杆菌； 免疫磁珠； 聚合酶链反应-酶联免疫吸附试验； 检测方法

结核病是由结核分枝杆菌感染引起的慢性传染病,是全球最具威胁的传染病之一。据世界卫生组织统计,我国患结核病人数居世界第2位，是全世界22个结核病流行严重的国家之一[1]。当前，我国在结核病控制方面所面临的问题是结核病的早期诊断,尤其是痰菌阴性肺结核的诊断[2]。目前，临床实验室常用的结核杆菌检测方法有抗酸染色镜检法、细菌培养法、抗结核抗体检测法及分子生物学检测法等[3]。其中，痰涂片抗酸染色镜检法方法简单、快速，但敏感性较差,每毫升标本中需5 000～10 000条菌才呈阳性结果[4]。培养法耗时较长，且不适合一般实验室开展(P2级以下实验室不允许做)。血清抗结核抗体检测在临床应用中也存在假阳性和假阴性的问题[5]。近年来，分子生物学技术检测结核分枝杆菌，克服了传统方法的诸多不足，能更快速、敏感、特异地鉴定结核杆菌感染。本文通过对比分析本室建立的免疫磁珠捕获联合双内标聚合酶链反应-酶联免疫吸附试验定量检测法(IMC-PCR-ELISA)与抗酸染色涂片法(AFS)、免疫磁珠-抗酸染色涂片法(IMC-AFS)、金标抗结核抗体检测法(DICA)、普通PCR在结核病诊断中的临床应用价值，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 标本来源 选取2010年10月至2013年11月镇江市第三人民医院(镇江市传染病医院)的102例临床诊断为肺结核且结核分枝杆菌培养阳性的患者痰标本和血清标本作为阳性对照；选取镇江市第二人民医院的48例结核分枝杆菌培养阴性的非结核普通住院患者的痰标本和血清标本作为阴性对照。质控菌株：结核分枝杆菌标准菌株H37Ra、非结核分枝杆菌来自镇江市第三人民医院(镇江市传染病医院)；大肠埃希菌(ATCC 25922)、金黄色葡萄球菌(ATCC 25923)、绿脓假单胞菌(ATCC 27853)菌株为本室保存。

1.2 仪器与试剂

1.2.1 酸性罗氏培养基、对硝基苯甲酸(PNB)和噻吩-2-羟酸肼(TCH) 鉴别培养基、抗酸杆菌染色液均由珠海贝索生物技术有限公司提供。

1.2.2 免疫磁珠 Dynal公司生产的rabbit-IgG Dynabeads磁珠表面结合结核分枝杆菌抗体(Abcam公司产品)。

1.2.3 结核分枝杆菌IgG抗体检测试剂盒由南京大渊生物技术工程有限责任公司提供。

1.2.4 PCR试剂盒为日本Takara生物技术有限公司产品；引物、高/低内标模板(内标模板与 PCR 扩增目的片段等长且与目的模板在引物区的序列相同)、杂交探针(3′端用地高辛标记)由宝生物工程(大连)有限公司合成。

1.2.5 主要仪器 Hettich-UNIVERSAL16R 型低温高速离心机(德国Hettich 公司产品)；Mastercycler Personal 5332型 PCR扩增仪(德国Eppendorf公司产品)；国产 BS-423 型电泳仪(北京生化仪器厂产品)；国产 MD-300 型紫外多功能分析仪(镇江美达生物仪器有限公司产品)。

1.3 方法

1.3.1 标本处理 患者晨痰标本加入等量消化剂,涡旋振荡30 s,室温静置15 min,其间摇动数次,使痰液完全液化无痰丝。取液化痰液 1 mL 5 000转离心10 min,沉淀加入 0.5 mL pH值7.2的磷酸盐缓冲液(PBS)混匀；清晨空腹抽取患者外周静脉血5 mL,分离血清。

1.3.2 分枝杆菌培养及鉴定按照《结核诊断实验室检验规程》执行。

1.3.3 AFS操作步骤 取处理后的痰标本0.1 mL在玻片右侧2/3处,均匀涂抹成2.0 cm×2.5 cm的卵圆形痰膜,自然干燥后火焰固定,加石碳酸复红溶液,徐徐加热至有蒸汽出现，染5 min,水洗。加脱色剂,不时摇动玻片至无色脱落为止,水洗。加复染液,染0.5～1.0 min,水洗，待玻片干燥后镜检。

1.3.4 IMC操作步骤 在处理后的痰标本中加入结合有结核杆菌抗体的免疫磁珠 20 μL,置混匀仪上反应 30 min,经清洗后收集磁珠,加入0.2 mL ddH2O混匀后备用。

1.3.5 IMC-AFS操作步骤 取捕获处理后的免疫磁珠0.1 mL，加10 μL小牛血清，混匀后同AFS制片染色，干燥后镜检。

1.3.6 DICA操作步骤 按试剂盒说明书操作。

1.3.7 普通PCR操作步骤 取捕获处理后的免疫磁珠0.1 mL，煮沸10 min,取上清为模板[6]；在PCR反应管中加入10×PCR buffer(Mg2+Plus)5 μL,2.5 mmol/L的 dNTP 4 μL,上、下游引物各 15 pmol(根据结核分枝杆菌复合体群IS61lO序列设计的特异性引物),Taq酶 2 U，模板液2.5 μL。PCR 反应参数为：预变性94 ℃ 4 min,变性 94 ℃ 35 s,退火 62 ℃ 35 s,延伸 72 ℃ 40 s,共35个循环，72 ℃ 再延伸 5 min；1%琼脂糖凝胶，1～5 V/cm，电泳溴酚蓝前沿距离凝胶前端1 cm时，切断电源。置于0.5 μg/mL溴化乙啶水溶液中，室温下染色20～30 min，自来水冲洗凝胶后，于紫外灯下观察。

1.3.8 IMC-PCR-ELISA操作步骤 (1) 样本模板制备同上。(2)在PCR反应管中加入10×PCR buffer(Mg2+Plus)5 μL,2.5 mmol/L的 dNTP 4 μL,上、下游引物各 15 pmol(根据结核分枝杆菌复合体群IS61lO序列设计的特异性引物，上游引物的5′端用生物素修饰),Taq酶 2 U，再加入50拷贝数的低标内参模板和10 000拷贝数的高标内参模板及样本模板2.5 μL，最后加 ddH2O 至 50 μL；PCR 反应参数为：预变性94 ℃ 4 min,变性 94 ℃ 35 s,退火62 ℃ 35 s,延伸72℃ 40 s,共20个循环，72 ℃再延伸3 min。(3)从反应后的 PCR管中分别取10 μL到3孔加有100 μL稀释液(0.01 mol pH7.2 PBS)的链霉亲和素预包被微孔板中，混匀，放置45 ℃水浴40 min，水洗；(4)加100 μL碱变性液(1.5 mol氯化钠,0.15 mol氢氧化钠),37 ℃水浴15 min，加1 mol HEPES 35 μL，混匀后，水洗。(5)在3孔中分别加入100 μL与3种模板对应的探针杂交液(探针溶度为0.05 pmol/μL),放置 45 ℃水浴 40 min，水洗。(6)加50 μL抗DIG酶标记抗体，放置37 ℃ 30 min，水洗，加入底物37 ℃ 15 min，加 50 μL 2 mol/L硫酸终止反应，5 min内酶标仪450 nm测吸光度值，参考波长为630 nm。(7)计算公式为：Y=10X,其中X=lg(低标拷贝数)+(lg(高标拷贝数)-lg(低标拷贝数)×(目的模板吸光度值-低标吸光度值)/(高标吸光度值-低标吸光度值)。

1.3.9 DICA结果判断 按试剂盒说明书判断结果。

1.3.10 IMC-PCR-ELISA结果判断 用酶标仪测量高标内参、低标内参、目的模板3个检测孔分别在 450 nm处的吸光度值(参考波长为 630 nm)，再用上述公式计算目的模板的拷贝数；检测灵敏度：通过试验确定，在PCR反应体系中，最佳低标内参模板量为 50拷贝数，高标内参模板量为 10 000拷贝数。通过加入系列不同拷贝数的目的模板，检测出本试验的最低检测限为 5 copy/μL。阳性质控菌株:结核分枝杆菌标准菌株H37Ra；阴性质控菌株:非结核分枝杆菌、大肠埃希菌(ATCC 25922)、金黄色葡萄球菌(ATCC 25923)、绿脓假单胞菌(ATCC 27853)。

2 结 果

2.1 普通PCR 245 bp处扩增出目的条带为阳性结果，见图1。

图1 PCR扩增结核分枝杆菌IS6110检测结果

2.2 5种结核分枝杆菌检测方法结果比较 见表1。

表1 5种方法对150例临床标本的检测结果

2.3 AFS及IMC-AFS结果判断 涂片中结核分枝杆菌及非结核分枝杆菌被染成红色，其他细菌染成蓝色。阳性质控菌株:结核分枝杆菌标准菌株H37Ra；阴性质控菌株:大肠埃希菌(ATCC 25922)。

3 讨 论

本室建立的采用IMC联合IMC-PCR-ELISA，首先通过抗结核杆菌抗体包被的免疫磁珠，能特异性地捕获结核分枝杆菌[7]。这样既起到了浓缩收集结核分枝杆菌的作用，又减少了标本中其他细菌对试验的干扰。然后，在PCR反应体系中加入目的模板和另外2个已知不同溶度的双内标模板，反应后得到3类扩增产物。由于其中一条引物的5′端用生物素进行了标记，生成的3类扩增产物均带有生物素标记。进一步用链霉亲和素包被的酶标板捕获PCR扩增产物，经变性解链后，用3套特异性探针(3′端用地高辛标记)与扩增产物分别进行杂交。再用抗地高辛酶标记抗体与杂交体上的地高辛结合,漂洗后加底物显色,测定吸光度值。最后根据3种模板起始拷贝数与检测的吸光度值呈正比的关系，通过公式计算得到目的模板的起始拷贝数。

本研究以结核分枝杆菌培养法为金标准，将培养结果为阳性的102例患者的痰标本和血清标本作为阳性对照，以48例培养结果为阴性的非结核患者痰标本和血清标本作为阴性对照。对IMC-PCR-ELISA与其他临床常用的几种结核杆菌检测方法进行了对比分析，结果显示，AFS简单、快速，但敏感性(35.29%)较差，与文献[8]报道结果一致；IMC-AFS由于结合了免疫磁珠捕获技术，敏感性(43.14%)较AFS高。但上述两种方法，结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌均显示阳性，不能有效区分。DICA检测的是血清中抗结核抗体，其敏感性较涂片法高，但由于非结核患者中因免疫接种等原因会有一定的假阳性结果出现，本次测试中该法的特异性(75.00%)为5种检测方法中最低的。普通PCR显示出较高的敏感性(91.67%)和特异性(93.14%)，但仍出现4例假阳性和7例假阴性，经分析其中假阴性结果为目的模板的拷贝数较低而导致，假阳性结果则为非特异性扩增所致。本室建立的IMC-PCR-ELISA定量检测结核分枝杆菌方法,通过磁性微粒表面包被抗结核分枝杆菌抗体，可特异性捕获结核分枝杆菌，起到了浓缩收集目的菌和减少干扰的作用，再联合PCR检测技术能显著提高目的基因的检出率，其灵敏度要比单独PCR增加8～2 000倍[9-11]。同时，分子杂交技术的应用，也大大提高了方法的特异性[12]。此外，双内标PCR技术实现了定量检测目的模板起始拷贝数的目的。IMC-PCR-ELISA检测全过程约4.5 h,最低检测限为5 copy/μL，特异性和敏感性均为100.00%。结果显示，IMC-PCR-ELISA具有快速、灵敏、特异、可定量检测的特点，是临床快速诊断结核病的有效检测方法。

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The clinical value of 5 kinds of mycobacterium tuberculosis detection method*

WANGZhen1，GONGYu-hua2，QIANCai-di1，SUNChun-hong2，WANGXue-mei2，SHIYu1，ZHOULi-ping3，FUXing-li3，SHAOQi-xiang3

(1.DepartmentofClinicalLaboratory,ZhenjiangSecondPeople′sHospital,Zhenjiang,Jiangsu212000,China;2.DepartmentofClinicalLaboratory,ZhenjiangThirdPeople′sHospital,Zhenjiang,Jiangsu212000,China;3.MedicalTechnologyCollegeofJiangsuUniversity,Zhenjiang,Jiangsu212002,China)

Objective To analyze and compare the detection method for tuberculosis by immunomagnetic beads capture combined with PCR-ELISA with double internal standard (IMC-PCR-ELISA) and other testing methods，and discuss its clinic application．Methods To tally 102 patients with culture-positive tuberculosis from sputum were used as positive control,48 nontuberculosis inpatients with culture-negative tuberculosis from sputum were used as negative control．And the sensitivity and specificity of smear acid-fast stain (AFS),immune magnetic beads smear acid-fast stain method (IMC-AFS),jinbiao anti-tuberculosis antibody assay (DICA),ordinary PCR and IMC-PCR-ELISA were compared．Results The results showed that the IMC-PCR-ELISA could yield quantitative results within about 4.5 h with a detection limit at 5 copy/μL,the specificity and sensitivity of this method were all 100.00%.The sensitivity of the AFS,IMC-AFS,DICA and ordinary PCR were 35.29%,43.14%,60.78% and 93.14%，while the specificity were 95.83%,95.83%,75.00% and 91.67%,respectively．Conclusion Compared with AFS，IMC-AFS，DICA and ordinary PCR,the IMC-PCR-ELISA is rapid,sensitive,secific and quantitative method for detecting tuberculosis,which can be taken as a helpful method for rapid detection of TB．

mycobacterium tuberculosis； immunomagnetic beads； PCR-ELISA； detection methods

江苏省镇江市社会发展基金资助项目(SH2010019)。

王震，男，本科，副主任技师，主要从事临床微生物检验工作。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.03.019

A

1672-9455(2015)03-0334-03

2014-08-24

2014-10-18)