林剑勇，邓益斌，罗艳红，陆小婵，黄永秩

(右江民族医学院附属医院:1.呼吸内科;2.医学检验科,广西百色 533000)



·论 著·

肺癌组织中miRNA-449a的表达及其临床意义*

林剑勇1，邓益斌2△，罗艳红2，陆小婵2，黄永秩2

(右江民族医学院附属医院:1.呼吸内科;2.医学检验科,广西百色 533000)

目的 探讨miRNA-449a在肺癌细胞中的表达及其临床应用价值。方法 收集右江民族医学院附属医院2011年1月1日至2013年6月30日收治的58例肺癌患者作为研究对象，采用逆转录荧光定量聚合酶链反应检测miRNA-449a在肺癌组织和癌旁正常组织中的表达量，分析miRNA-449a与临床病理特征的关系，并采用荧光电子显微镜观察miRNA-449a模拟物对体外培养肺癌细胞株95D细胞凋亡的影响。结果 鳞癌组和腺癌组miRNA-449a平均表达量均明显低于癌旁正常对照组(t=6.712，P<0.05;t=4.572，P<0.05)，其相对表达量与瘤体大小(U=78.412，P=0.012)有关，与患者年龄(U=920.000，P=0.615)、性别(U=800.000，P=0.215)、病理类型(χ2=4.221，P=0.155)和临床分期(U=754.000，P=0.009)无关。与阴性对照组比较，miRNA-449a模拟物可明显促进肺癌细胞的凋亡，且呈剂量依赖性。结论 miRNA-449a在肺癌组织中呈低表达，可诱导肺癌细胞凋亡，发挥抑癌基因的作用，可能成为肺癌早期诊断与治疗的新分子靶标。

miRNA-449a; 肺癌; miRNAs; 分子诊断

microRNA(miRNA)是近年来新发现的一种内源性、非编码单链小分子RNA，长度约为20～25个核苷酸，其主要功能是与靶基因mRNA的非编码区或编码区不完全互补结合，促使靶基因mRNA降解或抑制转录后蛋白翻译过程，并在细胞的生长、增殖、凋亡和分化方面扮演着重要角色[1-2]。miRNA-449a是5号染色体上miRNA-449的编码产物之一，在结直肠癌、肝癌和卵巢癌等癌症中均发现有表达且发挥一定生物学功能[3]。而miRNA-449a在肺癌中的表达及其生物学功能尚不清楚，因此，本研究拟采用逆转录荧光定量聚合酶链反应(PCR)技术分别检测肺癌组织及远端正常组织中miRNA-449a的表达差异，并观察其模拟物对人肺癌细胞株95D细胞凋亡的影响，探讨其生物学功能。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集2011年1月至2013年6月在本院就诊并经手术病理诊断确诊的肺癌患者手术切除新鲜标本58例，其中男40例，女18例;鳞癌22例，腺癌36例;年龄大于或等于50岁42例，年龄小于50岁16例;瘤体大于或等于5 cm 38例，瘤体小于5 cm 20例，取肺癌组织及远端对照正常组织(距癌组织大于5 cm)。所有肺癌患者术前均未做放疗、化疗及其他针对肿瘤的治疗。标本留取前已经医院伦理委员会批准，并由患者签署知情同意书。全部标本手术后30 min内保存于液氮中。人肺癌细胞株95D细胞用10%胎牛血清(含氨基酸和葡萄糖)的培养基于37 ℃、5%CO2湿化培养箱中培养。

1.2 仪器与试剂 Tizol试剂盒、LipofectaminTM2000等购自美国Invitrogen公司;逆转录荧光定量PCR试剂盒购自上海生工生物工程股份有限公司;AnnexinV-FITC细胞凋亡检测试剂盒购自南京凯基生物技术有限公司;引物及miRNA-449a模拟物的设计与合成由上海生工生物工程股份有限公司完成;荧光电子显微镜为尼康(Niko)公司产品;PCR扩增仪为美国Thermo公司产品。

1.3 方法

1.3.1 总RNA提取 从液氮中取组织约500 mg，采用Tizol试剂提取总RNA，利用紫外分光光度计检测提取RNA浓度和纯度，当A260/A280比值为1.8～2.1认为提取的RNA纯度合格，并采用1%琼脂糖凝胶电泳法鉴定RNA的完整性。当28S/18S亮度比值大于2.0认为提取的RNA完整性良好。

1.3.2 miRNA-449a定量检测 采用逆转录荧光定量PCR技术，以U6为内参。(1)内参U6引物设计：U6逆转录引物为5′-GTC GTA TCC AGT GCA GGG TCC GAG GTA TTC GCA CTG GAT ACG ACA AAA TAT GGA ACT GC-3′，上游引物为5′-GGG TGC TCG CTT CGG CAG C-3′，下游引物为5′-CAG TGC AGG GTC CGA GGT-3′。(2)总RNA逆转录为cDNA：利用逆转录引物，把总RNA逆转录为cDNA，其反应体系为10×逆转录缓冲液1.5 μL，100 nmol/L dNTPs 0.15 μL，逆转录酶1.0 μL，RNase抑制剂0.19 μL，逆转录引物3.0 μL，总RNA 5.0 μL，加焦碳酸二乙酯(DEPC)水至15 μL，轻轻混匀后，16 ℃ 30 min;42 ℃ 60 min;85 ℃ 5 min;4 ℃保存。(3)荧光定量PCR检测：反应体系为2×PCR缓冲液10 μL，20×miRNA-449a特定引物和荧光探针1 μL，逆转录产物1 μL，加DEPC水至20 μL，置ABI 7500荧光PCR仪上按照95 ℃ 5 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 45 s反应40个循环，采集数据分析结果。

1.3.3 miRNA-449a模拟物抑制细胞增殖分析 采用LipofectaminTM2000分别将不同浓度的miRNA-449a模拟物及阴性对照转染体外培养的人肺癌细胞株95D细胞进行分析，荧光电子显微镜下观察细胞凋亡情况。脂质体转染严格按试剂说明书操作。

1.4 统计学处理 采用SPSS18.0对数据进行统计分析。试验资料中的计量资料均做正态性检验。符合正态分布的资料，多组间比较行单因素方差分析及t检验;若不符合正态分布，两组各指标间的比较采用两独立样本非参数Mann-WhitneyU检验，多组间比较行Kruskal-Wallis分析。检验水准α=0.05，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 RNA纯度与miRNA-449a的表达 RNA经紫外分光光度计检测，A260/A280比值为2.06，A260/A230比值为2.21，说明总RNA纯度较高，无蛋白及DNA污染。图1显示，28S、18S条带清晰，28S/18S亮度比值大于2.0，说明提取的总RNA完整性好，无明显降解。癌旁正常对照组、鳞癌组、腺癌组miRNA-449a平均表达量分别为(2.74±1.55)、(1.48±1.63)和(1.52±1.54)，3组整体差异有统计学意义(F=56.81，P<0.05)。鳞癌组和腺癌组与癌旁正常对照组相比较均发现，miRNA-449a表达量显著性降低(t=6.712，P<0.01;t=4.572，P<0.01);鳞癌组miRNA-449a表达量与腺癌组相比较，差异无统计学意义(P>0.05)。

2.2 miRNA-449a表达与临床病理特征关系 见表1。将58例肺癌患者按照临床病理特征因素(年龄、性别、病例类型、临床分期和瘤体大小)进行分类，进一步分析miRNA-449a相对表达量与肺癌患者临床特征的关系，表1显示，miRNA-449a表达与瘤体大小有关(P<0.05)，与其他临床病理特征无相关性(P>0.05)。

图1 总RNA琼脂糖凝胶电泳图

临床特征nmiRNA-449a相对表达量UP年龄(岁)<50161.88±0.78920.0000.615≥50421.83±0.91性别男401.91±0.93800.0000.215女181.85±0.82病理类型鳞癌222.01±0.884.221*0.155腺癌361.75±0.81临床分期Ⅰ～Ⅱ211.55±0.82754.0000.091Ⅲ～Ⅳ371.89±0.78瘤体(cm)<5201.23±0.7378.4120.012≥5380.62±0.59

注：*Kruskal Wallis检验;其余Mann-Whitney检验。

2.3 miRNA-449a模拟物对细胞凋亡的影响 转染48 h后，采用MTT比色法测定各组A值，阴性对照组、10 mg/mL组和20 mg/mL组A值分别为(1.35±1.02)、(0.71±0.54)和(0.45±0.38)，3组整体差异有统计学意义(F=57.33，P<0.05)。图2显示，10 mg/mL组和20 mg/mL组细胞凋亡数(染成红色)显著高于阴性对照组。

注：a为阴性对照组;b为脂质体对照组;c为10 mg/mL模拟物组;d为20 mg/mL模拟物组。

图2 荧光电子显微镜下，miRNA-449a诱导肺癌细胞株

95D细胞凋亡情况(化学发光法，200×)

3 讨 论

肺癌是一种多基因疾病，其发生、发展是多因素参与、多种相关基因失活共同作用的结果，是高发病率和高病死率的癌症之一，也是预后较差的癌症之一。miRNA是一类长约20～23 nt的可调控基因表达的高度保守非编码小RNA，在肿瘤发生、发展和转移中起促进或抑制的作用。有资料表明，miRNA-145[4]、miRNA-34a[5]、miRNA-212[6]、miRNA-182[7]等miRNA可通过增加凋亡蛋白的表达，诱导肿瘤细胞凋亡，从而阻遏肿瘤细胞生长。此外还发现肺癌患者血清中miRNA-21的表达显著高于良性肺部疾病患者及健康体检者[8]。因此认为，miRNA可能成为肿瘤基因诊断与治疗研究的潜在靶标，是目前肿瘤领域的研究新热点。

本研究结果显示，miRNA-449a在肺癌组织中的表达明显比正常对照组低,差异有统计学意义(P<0.05)，而且与肿瘤大小有关(P<0.05)，与年龄、性别无关，提示miRNA-449a参与了肺癌的发生、发展过程，可能是一项潜在的抑癌因子，但其表达机制仍不清楚，可能与表观遗传学(如甲基化等)的调控有关。为了验证miRNA-449a对肿瘤细胞增殖和凋亡的作用机制，本研究设计合成miRNA-449a模拟物，并以阳离子脂质体介导体外转染肺癌细胞株95D细胞。荧光电子显微镜下观察发现，与阴性对照组比较，miRNA-449a模拟物能够明显诱导肺癌细胞凋亡，且随着miRNA-449a浓度增高肿瘤细胞的凋亡呈上升趋势，说明miRNA-449a通过诱导肺癌细胞凋亡来发挥抑癌基因的作用，但诱导或阻断哪些凋亡蛋白的表达，从而上调或下调哪些通路的信号，还有待进一步研究。

尽管本研究结果初步证实miRNA-449a在肺癌细胞中有抑癌基因作用，但体外试验细胞微环境毕竟与体内不同，有可能因为细胞表观遗传学的改变影响试验结果的准确性，因此，有待进一步在动物试验中加以验证。

总之，miRNA-449a在肺癌发生、发展过程中通过诱导细胞凋亡发挥抑癌基因的作用，可能成为肺癌早期诊断与治疗的新分子靶标。

[1]Guo H,Ingolia NT,Weissman JS,et al.Mammalian microRNAs predominantly act to decrease target mRNA levels[J].Nature,2010,466(738):835-840.

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[3]Yang X,Feng M,Jiang X,et al.miR-449a and miR-449b are direct transcriptional targets of E2F1 and negatively regulate pRb-E2F1 activity through a feedback loop by targeting CDK6 and CDC25A[J].Genes Dev,2009,23(20):2388-2393.

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Expression and and its clinical significance of miRNA-449a in lung cancer*

LINJian-yong1,DENGYi-bin2△,LUOYan-hong2,LUXiao-chan2,HUANGYong-zhi2

(1.DepartmentofRespiratory;2.DepartmentofClinicalLaboratory,AffiliatedHospitalofYoujiangMedicalCollegeforNationalities,Baise,Guangxi533000,China)

Objective To investigate the expression and and its clinical significance of miRNA-449a in lung cancer.Methods Totally 58 patients with lung cancer were selected as research objects from Affiliated Hospital of Youjiang Medical College for Nationalities on January 1,2011 to June 30,2013.The expression of miRNA-449a in lung cancer tissues and matched normal tissues were detected by real time PCR.And the relationship between clinical pathological features and the level of miRNA-449a were analysed.Fluorescent electronic microscope was applied to analyze the apoptosis after transfecting mimics of miRNA-449a into non-small cell lung cancer.Results The level of miRNA-449a was significantly lower in squamous carcinoma group and adenocarcinoma group than that of control group(t=6.712，P<0.05;t=4.572，P<0.05;respectively).There was correlation between miRNA-449a and tumor size(U=78.412，P=0.012) and no correlation between miRNA-449a and age(U=920.000，P=0.615),gender(U=800.000，P=0.215),pathological type(χ2=4.221，P=0.155)and clinic stage(U=754.000，P=0.009),allP>0.05.Compared with negative control group,miRNA-449a mimics could induce apoptosis of lung cancer cell 95D with dose-effect dependent.Conclusion miRNA-449a is lower expression in lung cancer,can induced apoptosis,which maybe play a role as a tumor suppressor gene,and as a new molecular targets of early diagnosis and treatment of lung cancer.

miRNA-449a; lung cancer; microRNAs; molecular diagnostic

广西壮族自治区自然科学基金(2011GXNSFA04215)。

林剑勇，男，硕士，副主任医师，主要从事呼吸系统疾病，尤其是肺癌的基础与临床研究。△

,E-mail:dengyb75@163.com。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.03.011

A

1672-9455(2015)03-0314-03

2014-08-12

2014-10-10)