高 辉，彭传梅，付晓野，曹向红，董玉琳，王 杨(昆明医科大学附属延安医院医学检验科，昆明 650051)



云南汉族人群Tim-3启动子区-1516G>T位点多态性与系统性红斑狼疮关联性研究*

高 辉，彭传梅△，付晓野，曹向红，董玉琳，王 杨(昆明医科大学附属延安医院医学检验科，昆明 650051)

目的 探讨T细胞免疫球蛋白域和黏蛋白域蛋白(Tim)-3启动子区-1516G>T位点基因多态性与云南高原地区汉族人群系统性红斑狼疮(SLE)的遗传易感性及其相关自身抗体的表达有无关联。方法 采用限制性片段长度多态性聚合酶链反应方法对132例云南汉族SLE患者和120例健康体检者Tim-3启动子区多态性位点-1516G>T的基因多态性进行检测，同时采用间接免疫荧光法和线性免疫印迹法检测其双链DNA抗体、Sm抗体、核糖核蛋白抗体三种自身抗体。采用直接计数法计算基因型和等位基因频率，进行Hardy-Weinberg平衡检验，基因型和等位基因频率的组间比较、各自身抗体和基因型的相关性比较均采用χ2检验。结果 云南汉族人群Tim-3启动子区多态性位点-1516G>T的基因型GG、GT、TT在SLE组频率为：0.818 2、0.181 8、0.000 0，在对照组频率为：0.916 7、0.075 0、0.008 3，其基因型和等位基因频率在两组间差异有统计学意义(P<0.05)。结论 云南汉族人群Tim-3启动子区-1516位点存在单核苷酸多态性变异，且其多态性变异与系统性红斑狼疮遗传易感性相关，但其不同基因型可能不会影响SLE相关自身抗体的表达。

系统性红斑狼疮； T细胞免疫球蛋白域黏蛋白域蛋白-3； 基因多态性； 遗传易感性

系统性红斑狼疮(SLE)是一种临床表现多样、涉及机体许多系统和脏器的自身免疫性疾病，其发病率在种族、地区上差别很大。SLE的病因和发病机制尚未完全清楚，一般认为遗传、环境等为其发病诱因。T细胞在SLE的发病过程中扮演重要角色，在其发病的不同环节均存在辅助性T细胞(Th)1/Th2的不平衡性[1]。T细胞免疫球蛋白域和黏蛋白域蛋白(Tim)基因家族是Mcintire等[2]于2001年发现的一个新的基因家族。小鼠Tim家族基因共有8个成员(Tim 1～8)，人Tim家族基因与小鼠有高度的同源性，在人类Tim家族发现只有3个基因，分别为Tim-1、Tim-3和Tim-4，无Tim-2，定位于染色体5q33.2区域。人Tim-3基因全长约23 kb，包含有7个外显子，编码产物为301个氨基酸。Monney等[3]用定量RT-PCR方法检测Tim-3基因在许多细胞系(Th1、Th2、DCs、B细胞)以及SJL小鼠的T、B、CD11b+细胞上的表达，发现Tim-3 mRNA只高表达于Th1细胞。由此表明Tim-3是重要的免疫调节分子，在自身免疫性疾病等Th1/Th2相关性疾病中发挥重要作用。国内外研究显示，人类Tim-3的启动子区和编码区均存在多态性的变化，这些多态性可能与哮喘、过敏性鼻炎和类风湿性关节炎(RA)等疾病的易感性相关[4-7]。Tim家族基因是否参与SLE的发生、发展目前少有报道。云南地处高原、紫外线辐射较强，为SLE高发地区，因此，笔者对云南高原地区汉族人群Tim-3启动子区多态性位点-1516G>T的多态性与SLE以及与SLE相关自身抗体的关联进行研究，为探索SLE易感的遗传因素提供数据支持，为揭示SLE发病机制提供新的依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集2011年10月至2013年10月在本院风湿免疫科就诊的SLE患者132例，其中男16例，女116例；年龄18～58岁；SLE患者符合2009年美国风湿病协会修订的SLE分类诊断标准。对照组为120例云南地区健康体检者，其中男27例，女93例；年龄22～67岁，无自身免疫性疾病相关病史。所有对象均为三代以内居住在云南本地汉族居民，所有对象均无血缘关系。

1.2 仪器与试剂 PCR扩增仪(DA7600，China)；电泳仪(Bio-rad，USA)；凝胶成像系统(Bio-rad，USA)；荧光显微镜(Leica，Germany)；测序仪(ABI3730，USA)。人全血基因DNA提取试剂盒(Axygen，USA)；TaqDNA聚合酶1 U(Omega，USA)；dNTPs(Omega，USA)；琼脂糖(Biowest,Spain)；荧光染料(EB，USA)；荧光免疫印迹试剂盒(Omon，Germany)；测序试剂盒(ABI，USA)。

1.3 方法

1.3.1 自身抗体检测 在知情同意的原则下，采集SLE患者及健康体检者乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝静脉血2 mL。SLE组及对照组均采用荧光免疫印迹试剂盒(Omon，Germany)检测三种自身抗体：双链DNA抗体(dsDNA)、Sm抗体、核糖核蛋白(RNP)抗体。

1.3.2 模板DNA提取 采用人全血基因DNA提取试剂盒(Axygen，USA)提取SLE患者及健康体检者外周血基因组DNA，方法严格按照试剂盒说明书进行，提取产物溶于TE缓冲液，-20 ℃保存。

1.3.3 PCR反应 参照GenBank中Tim-3 DNA序列(编号AC023133)，利用Primer Premier 5.0软件自行设计合成一对引物，P1：5′-GCC TTG ACC AAG TTC ATG CT-3′和P2：5′-ACC ACC CCG GAT AAT TTT GT-3′，PCR反应体系总体积25 μL：包括基因组DNA 100 ng，10×PCR缓冲液2.5 μL，2.0 mmol/L Mg2+、dNTPs各10 nmol，引物P1和P2各15 pmol，TaqDNA聚合酶1U(Omega，USA)，不足体积用灭菌双蒸水补充至25 μL。PCR反应循环参数：94 ℃预变性5 min，94 ℃ 40 s，55 ℃ 40 s，72 ℃ 60 s，35个循环，最后72 ℃延伸10 min。

1.3.4 酶切、琼脂糖电泳 PCR产物用BslⅠ内切酶(Omega，USA)酶切：PCR产物5 μL，10×酶切缓冲液1 μL，限制性内切酶2 U，灭菌双蒸水3.9 μL，混匀，55 ℃酶切3 h。酶切产物用2%琼脂糖电泳、EB染色，观察条带。根据电泳图确定基因型。

1.3.5 测序 选取部分代表不同基因型的扩增产物送上海生物工程公司测序，验证电泳结果。

1.4 统计学处理 应用SPSS17.0软件进行统计分析，采用直接计数法计算基因型和等位基因频率，进行Hardy-Weinberg平衡检验(P>0.05)，基因型和等位基因的组间比较、各自身抗体和基因型的相关性比较均采用χ2检验，P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 Tim-3启动子区-1516G>T位点多态性采用PCR-RFCP分析，PCR扩增产物长度为404 bp。酶切产物获得3种基因型，即纯合子GG基因型：有338、66 bp 2个片段；杂合子GT基因型：可见404、338和66 bp 3个片段；纯合子TT基因型：仅有404 bp 1个片段，见图1。

注：1为marker；2、4、6为GG基因型；3、5为GT基因型；7为TT基因型；8为PCR产物。

2.2 基因型测序分析图 Tim-3基因启动子-1516G>T位点GG、GT、TT 基因型测序分析图，见图2。

注：(a)GG基因型；(b)GT基因型；(c)TT基因型。

2.3 基因型与等位基因频率分布 根据PCR产物酶切电泳结果，记录各样本的基因型，并采用直接计数法统计基因型，计算等位基因频率。SLE组和对照组-1516G>T位点基因型频数分布均符合Hardy-Weinberg遗传平衡定律(P>0.05)，达到遗传平衡，具有群体代表性，见表1。χ2检验结果显示，SLE组与对照组-1516G>T位点基因型和等位基因频率分布比较，差异有统计学意义(P<0.05)，见表2。

表1 Tim-3基因-1516G/T位点基因型频数分布的Hardy-Weinberg平衡检验

2.4 三种SLE相关自身抗体(双链DNA抗体、Sm抗体、RNP抗体) 检测结果表明，SLE组三种自身抗体检测阳性率均高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)，见表3。SLE组各基因型三种自身抗体检测结果，见表4。经χ2检验，SLE组中双链DNA抗体、Sm抗体、RNP抗体检测阳性率与Tim-3基因启动子-1516G>T位点基因分型均无相关性(P>0.05)，见表4。

表2 Tim-3基因-1516G/T位点基因型及等位基因频率分布[n(%)]

表3 2组三种自身抗体检测阳性率比较(%)

表4 SLE组各基因型中三种自身抗体检测结果[n(%)]

3 讨 论

人类基因组单核苷酸多态性是基因组变异中最常见的一种形式，在人类基因组中大概每1 000个碱基就有1个SNP。不同人群之所以对疾病的易感程度有所区别、同种疾病的临床表型不同以及对药物会产生不同反应，部分受到SNP的影响。SNP作为第3代遗传标记，在复杂疾病的基因定位、关联分析、个体疾病易感性分析、同种疾病临床表型分析以及药物基因组学的研究中发挥着越来越重要的作用。许多研究均表明，Tim基因遗传多态性与多种自身免疫性疾病和过敏性疾病的易感性、临床表型有着密切的关系，且不同种族、不同地区之间由于遗传特征不同导致多态性变异亦不同，但Tim基因多态性与SLE的关联研究尚处于起步阶段[8-10]。

本研究通过PCR-RFLP技术对132例SLE患者和120例健康人群Tim-3启动子区多态性位点-1516G>T的多态性进行分析。SLE组与对照组-1516G>T基因型分布均符合Hardy-Weinberg遗传平衡定律检验，达到遗传平衡，具有群体代表性。两组间基因型及等位基因频率比较，差异均有统计学意义，表明云南汉族人群Tim-3启动子区多态性位点-1516G>T的多态性与SLE的遗传易感性相关。

在SLE众多相关自身抗体中，双链DNA抗体、Sm抗体、RNP抗体三种抗体的检测意义尤为明显，其可能与疾病发病机制、疾病严重程度等密切相关[11]。本研究也发现，SLE组三种自身抗体检测阳性率均高于对照组，差异有统计学意义。细胞因子基因编码区的多态性可以通过抑制与特异性细胞因子受体的结合、启动靶细胞或靶分子的信号转导通路和二级信号通路，从而影响其编码蛋白的结构和表达。相应地，这些变异也能够影响自身免疫反应，导致自身免疫性疾病不同的病情严重程度以及自身抗体水平的差异，因此笔者分析了SLE三种自身抗体检测阳性率与Tim-3基因启动子区-1516G>T位点基因分型的关系，发现三种自身抗体检测阳性率与Tim-3基因启动子区-1516G>T位点基因分型均无明显相关性，提示Tim-3基因-1516G>T位点不同基因型可能不会影响SLE相关自身抗体的表达，但其对Tim-3基因表达水平的影响及SLE疾病严重程度的影响尚有待于进一步研究证实。

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Association analysis of Tim-3 -1516G>T polymorphism with systemic lupus erythematosus in a han population of Yunnan Province*

GAOHui,PENGChuan-mei△,FUXiao-ye,CAOXiang-hong，DONGYu-lin，WANGYang

(DepartmentofMedicalLaboratory,TheAffiliatedYananHospitalofKunmingMedicalUniversity,YunnanKunming650051,China)

Objective The aim of the present study was to analyze the association between the Tim-3 polymorphism -1516G>T and susceptibility to systemic lupus erythematosus(SLE) in a group of Han population from Yunnan province.Methods Polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism analysis(PCR-RFLP) was used to detect the polymorphism of -1516G>T site in 132 SLE patients and 120 controls.and we used indirect immunofluorescence assay and liner immunoblotting to detect three related aotuantibodies of SLE,which include the anti-double stranded DNA(dsDNA)antibody,the anti-Sm antibody and the anti-RNP antibody.We used direct counting method to calculate the genotype and allele frequencies to conduct the Hardy-Weinberg equilibrium test,and we used χ2test to compare the difference of the genotypic and allelic frequencies between SLE and control groups and the correlation of autoantibodies and genotypes.Results We found there are statistically significant differences in genotype and allele frequency of -1516G>T between SLE and control group(P<0.05);The genotype(GG,GT,TT)frequency in the SLE group is 0.818 2,0.181 8 and 0.000 0,which in the control group is 0.916 7,0.075 0 and 0.008 3 respectively.Conclusion The -1516 site of Tim-3 gene has SNP variations，the -1516G>T genotype maybe related with the susceptibility to SLE in a Han population of Yunnan province,but different genotypes may not affect the expression of related autoantibodies of SLE.

SLE； Tim-3； gene polymorphism； susceptibility

云南省科技厅-昆明医科大学联合专项项目(2011FB232)。

高辉，女，主任医师，硕士，主要从事临床血液学检验和分子生物学检验方面的研究。△

，E-mail：meizimh@sina.com。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.08.004

A

1672-9455(2015)08-1034-03

2014-11-05

2015-01-12)