詹俊琳 于 力 张 俊 于生友

(1广州医科大学附属第二医院儿科, 广东 广州 510260；2广州市第一人民医院儿科，广东 广州 510182)

·临床研究·

肾病综合征患儿外周血IL-17水平检测的临床意义

詹俊琳1于 力2*张 俊2于生友2

(1广州医科大学附属第二医院儿科, 广东 广州 510260；2广州市第一人民医院儿科，广东 广州 510182)

目的:探讨白细胞介素-17(IL-17)在激素敏感型肾病综合征(SSNS)和激素依赖型肾病综合征(SDNS)患儿外周血单个核细胞(PBMC)中检测的临床意义，并且阐明IL-17参与儿童NS的发病机制及临床作用。方法:选择2012年1月至2014年3月在广州市第一人民医院住院的原发性肾病综合征(PNS)患儿47例，其中，SSNS 20例，SDNS27例，并选择20例健康儿童为对照组。两组患儿治疗前和治疗4周后分别采血检测血清白蛋白(ALB)、总胆固醇(TC) 、甘油三酯(TG)、血尿素氮(BUN) 、血肌酐(Scr) 、血和尿β2- 微球蛋白(β2-MG)及24h尿蛋白定量检测。应用酶联免疫吸附试验(ELISA)方法检测PBMC在植物血凝素(PHA)刺激下培养液上清的IL-17浓度，分析IL-17浓度与24 h尿蛋白定量的相关性。结果:与治疗前比较，SSNS组和SDNS组患儿的ALB、 TC、 TG、 BUN、 Scr、β2-MG以及24h尿蛋白定量水平差异有统计学意义(P<0.05)；但两组间比较，以上指标差异无统计学意义(P>0.05)。治疗前两组患儿IL-17的浓度均明显高于对照组(P<0.05)，治疗后SDNS组IL-17浓度明显高于SSNS组与对照组(P<0.05)。直线回归分析显示，治疗前两组患儿IL-17浓度与24 h尿蛋白值呈正相关(r=0.949，P<0.01)；治疗后SDNS组IL-17浓度下降值与24 h尿蛋白定量下降值呈正相关(r=0.767，P<0.01)。结论:IL-17在儿童PNS的发生发展中起着一定的作用，推测IL-17可能是引起NS患儿激素依赖的重要原因，因此监测IL-17浓度的变化可以作为观察儿童PNS疗效的一个重要临床指标。

肾病综合征；白细胞介素17；外周血单个核细胞

原发性肾病综合征(primary nephrotic syndrome，PNS)是儿童肾脏病中最常见的一种肾小球疾病，大部分儿童PNS对激素治疗敏感，但也有40%患儿会出现复发[1]。对于这类患儿，需要重新使用足量激素、延长激素使用时间或者联合使用其他的免疫抑制剂，这些治疗措施会带来生长抑制、肿瘤发生率增加等副作用。因此，我们需要从发病机制研究这部分激素依赖的肾病综合征患儿，寻找副作用更小的治疗方法。目前有研究[2]表明白细胞介素-17(IL-17)在PNS的发病机制中占有一定作用，所以，本研究探讨IL-17与PNS患儿产生激素依赖的关系。

1 资料与方法

1.1 临床资料

选择2012年1月至2014年3月在广州市第一人民医院儿科住院的PNS患儿47例，其中，SSNS 20例，SDNS 27例；男29例，女18例；年龄2～14岁，中位年龄6岁；肾炎性肾病31例，单纯性肾病16例；健康儿童为对照组20例。

1.2 诊断标准

全部NS患儿均符合2009年中华医学会儿科分会肾脏病学组制定的《激素敏感、复发/依赖肾病综合征诊治循证指南(试行)》PNS诊断标准[3]。

1.3 观察指标

观察SSNS和SDNS患儿治疗前和治疗4周后各项生化指标：血清白蛋白(ALB)、总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、血尿素氮(BUN)、血肌酐(Scr) 、血和尿β2- 微球蛋白(β2-MG)以及24 h尿蛋白定量检测。

1.4 PBMC上清液中IL-17浓度检测

1.4.1 IL17标准曲线的建立 人IL-17药盒购自深圳晶美生物工程有限公司。将试剂盒标准品(冻干品)每瓶以样品稀释液稀释至300 μL，浓度为50 pg/mL，静置10 min以上，再进行系列倍比稀释，分别稀释成不同浓度的标准品50.00、25.00、12.50、6.25、3.12、1.56、0.78 pg/mL，其原液作为最高标准浓度，样品稀释液直接作为标准浓度0，临用前15 min内配置。分别设空白孔、标准孔、待测样品孔加样，酶标板加盖或覆膜，置于37 ℃条件120 min后，弃孔内液，甩干。每孔加检测溶液A工作液100 μL，温育60 min，弃孔内液，甩干，专用洗涤液洗板3次，每次加入洗涤液350 μL/孔，浸泡(1～2)min，甩干；每孔加检测溶液B工作液100 μL，温育60 min，弃孔内液，甩干洗板，每次浸泡(1～2)min，350 μL/孔，甩干；依序每孔加底物液90 μL，37 ℃避光显色，依序加中止液50 μL/孔，终止反应，用酶联仪在450 nm处读IL-17表达，加中止液后15 min内检测。各孔(包括零孔)吸光度(A)值应减去零孔(标准浓度)的A值。以标准品浓度为横坐标，A值为纵坐标，绘制标准曲线。根据标本A值在标准曲线上测IL-17含量。

1.4.2 PBMC培养与IL-17检测 取清晨空腹静脉血4 mL，置抗凝管，经离心后分离PBMC，调整细胞浓度至2×106/mL，用台盼蓝拒染法观察细胞活性。在培养液中加入植物血凝素(PHA,20 μg/mL)，37 ℃和5%CO2条件下培养48 h，分别于PHA刺激12、24和48 h收集细胞与上清液。应用酶联免疫吸附试验(ELISA)方法进行培养液上清IL-17浓度的检测。

1.5 病理改变

SDNS患儿部分接受肾穿刺活检，病理诊断分别是局灶节段性肾小球硬化(FSGS)3 例，轻度系膜增生性肾小球肾炎(MsPGN)6例，中度MsPGN 4例及膜性肾病(MN)3例，因为病例少，未纳入统计分析。

1.6 统计学处理

2 结 果

2.1 生化指标变化

与治疗前比较，治疗后SSNS组患儿和SDNS组患儿的ALB明显升高，TC 、TG、BUN 、Scr 、血和尿β2-MG以及24h尿蛋白定量均显著下降，差异均有统计学意义(P<0.05)；但上述各项观察指标在两组患儿间差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 SSNS和SDNS治疗前、后两组血液生化与尿蛋白指标的变化±s)

注：与治疗前(0周)相比，*P<0.05

2.2 IL-17浓度变化

治疗前两组患儿与对照组比较，IL-17的浓度均明显升高(P<0.05)；治疗后SDNS组IL-17浓度明显高于SSNS组和对照组(P<0.05)。见表2。

表2 各组血IL-17的水平变化

注：与对照组比较，*P<0.01;与SSNS组4周时间比较，#P<0.05

2.3 IL-17与24 h尿蛋白的关系

直线回归分析显示，治疗前两组患儿IL-17浓度与24 h尿蛋白值呈正相关(r=0.949，P<0.01)，见图1；治疗后SDNS组IL-17浓度下降值与24 h尿蛋白定量下降值呈正相关(r=0.767，P<0.01)，见图2。

图1 治疗前IL-17浓度与尿蛋白定量值直线回归分析结果

图2 治疗后SDNS组IL-17浓度下降值与24 h尿蛋白下降值直线回归分析结果

3 讨 论

白细胞介素17(interleukin17, IL-17)是由155个氨基酸组成的半球形糖蛋白，相对分子质量为35kDa[4]，由辅助性T淋巴细胞(Th17细胞)合成，能够促进趋化因子分泌、募集炎症因子。动物实验表明在哺乳类动物中，IL-17是机体防御细菌及真菌感染的重要炎症因子，而且IL-17还参与了机体自身免疫防御的发病过程，例如哮喘、类风湿关节炎及系统性红斑狼疮等[4-6]。Liu等[7]发现在微小病变合并急性肾衰竭的肾病综合征患者，IL-17的表达明显增加，而Th17/Treg的比例在激素治疗起效后恢复正常。国内杨青梅等[8]在原发性IgA肾病患者中发现外周血中IL-17的表达与病理组织中肾小球新月体形成有明显相关，可能成为肾小球损伤新的标志物和预后判断指标。在肾移植患者[9]中，IL-17旁路是环孢素A等免疫抑制治疗失败(抑制TH1/IFN-y通路)的免疫逃逸通路。还有研究表明[10]，微小病变型(MCD)的NS患者尿中的IL-17浓度升高，在NS缓解后，浓度显著下降。这些研究均表明IL-17在肾病的发病机制中有重要作用。

肾小球病也是一种自身免疫调节紊乱相关的疾病，本研究发现在PNS患儿中，治疗前PBMC表达IL-17的浓度较正常儿童明显升高，证明IL-17在PNS的发病机制中占有一定的作用，这与Matsumoto等[10]的结果相一致，他们发现在MCD的PNS中，激素治疗前，患者尿中的IL-17排出明显增多，经治疗起效后，尿中IL-17排出减少。此外，还有研究[11]发现，在PNS患儿中，血IL-17及尿IL-17与尿蛋白的排泄呈正相关，我们的研究也证实了治疗前PBMC中的IL-17浓度与24h尿蛋白定量值明显相关，这说明的IL-17的浓度还可能与疾病活动的严重程度有关，并且是导致肾损伤的因素之一。目前已经在动物模型[5,12]及人类[13,14]的研究中发现，IL-17在疾病的活动期，会促进中性粒细胞的聚集，引发机体的免疫防御反应，一方面增强宿主免疫防御反应，但另一方面也会导致机体自身的损伤；而在人类的自身免疫性疾病中[15]，例如类风湿性关节炎，IL-17能够激活破骨细胞，导致关节损伤。而有研究者[16]在PNS的肾脏组织中检测到IL-17，说明IL-17可能在肾组织的损伤的部位发挥一定的作用。

本研究分析了20例SSNS患儿和27例SDNS患儿治疗前后IL-17浓度变化以及与24h尿蛋白定量值的关系。治疗前两组患儿间IL-17浓度及24h尿蛋白定量值无明显差异；治疗后SDNS组IL-17浓度明显高于SSNS组，两组患儿尿蛋白均下降，组间比较无明显差异。直线回归分析显示，治疗前IL-17浓度与尿蛋白定量值呈正相关，说明IL-17是导致尿蛋白产生的原因之一。激素治疗4周后，我们发现SSNS患儿PBMC中IL-17的浓度明显下降，但SDNS患儿即使在血生化指标恢复正常的情况下，IL-17仍然明显升高，这说明了IL-17可能在PNS患儿产生激素依赖的机制中具有重要作用。

因此，本实验证实IL-17在儿童PNS的发生发展中起着一定的作用。通过IL-17浓度变化与24h尿蛋白定量值的关系，推测IL-17可能是引起SDNS患儿复发的重要原因之一。监测治疗后IL-17浓度的变化可以作为观察儿童PNS疗效的重要临床指标。

[1] Niaudet P. Long-term outcome of children with steroid-sensitive idiopathic nephrotic syndrome[J]. CJASN,2009, 4(10):1547-1548.

[2] Kyrieleis HA, Lowik MM, Pronk I, et al. Long-term outcome of biopsy-proven, frequently relapsing minimal-change nephrotic syndrome in children[J].CJASN, 2009, 4(10):1593-1600.

[3] 中华医学会儿科学分会肾脏病学组. 激素敏感、复发/依赖肾病综合征诊治循证指南(试行) [J]. 中华儿科杂志,2009, 47(3)：167-170.

[4] Kolls JK, Linden A. Interleukin-17 family members and inflammation[J]. Immunity, 2004, 21(4):467-476.

[5] Linden A, Laan M, Anderson GP. Neutrophils, interleukin-17A and lung disease[J]. The European respiratory journal，2005, 25(1):159-172.

[6] 蔡小燕, 叶静华, 罗 敏. 辅助性T细胞17-调节T细胞平衡在系统性红斑狼疮中的意义[J].中华生物医学工程杂志,2012, 18(6):468-472.

[7] Liu LL, Qin Y, Cai JF, et al. Th17/Treg imbalance in adult patients with minimal change nephrotic syndrome[J]. Clinical immunology，2011, 139(3):314-320.

[8] 杨青梅，鲍晓荣.原发性IgA肾病外周血IL-17及TGF-pl的表达及意义[J].中国临床医学，2013,20(2)：154-156.

[9] Roedder S, Kimura N, Okamura H, et al. Significance and suppression of redundant IL17 responses in acute allograft rejection by bioinformatics based drug repositioning of fenofibrate[J]. PloS one，2013, 8(2):e56657.

[10] Matsumoto K, Kanmatsuse K. Increased urinary excretion of interleukin-17 in nephrotic patients[J]. Nephron, 2002, 91(2):243-249.

[11] Kilis-Pstrusinska K, Zwolinska D, Medynska A, et al. Interleukin-17 concentration in serum and urine of children with idiopathic nephrotic syndrome[J]. Przeglad lekarski, 2006, 63(Suppl 3):198-200.

[12] Ivanov S, Linden A. Th-17 cells in the lungs Expert review of respiratory medicine，2007, 1(2):279-293.

[13] van der Deen M, Timens W, Timmer-Bosscha H, et al.Reduced inflammatory response in cigarette smoke exposed Mrp1/Mdr1a/1b deficient mice[J]. Respiratory research, 2007, 8:49.

[14] 沈峰，赵鸣武，贺 落.慢性阻塞性肺痰病和支气管哮喘患者诱导痰中白介来-17水平及其意义[J].中华内科杂志,2004, 43(12):888-890.

[15] Honorati MC, Meliconi R, Pulsatelli L, et al. High in vivo expression of interleukin-17 receptor in synovial endothelial cells and chondrocytes from arthritis patients[J]. Rheumatology, 2001, 40(5):522-527.

[16] Shao XS, Yang XQ, Zhao XD, et al. The prevalence of Th17 cells and FOXP3 regulate T cells (Treg) in children with primary nephrotic syndrome[J]. Pediatric nephrology, 2009, 24(9):1683-1690.

(本文编辑:王馨)

Clinical significance of interleukin-17 expression level in peripheral blood of children with nephrotic syndrome

ZhanJunlin1,Yuli2,Zhangjun2,YuShengyou2

(1DepartmentofPediatrics,SecondAffiliatedHospitalofGuangzhouMedicalUniversity,Guangzhou510260;2DepartmentofPediatrics,GuangzhouFirstMunicipalPeople’sHospital,Guangzhou510182,China)

Objective:To investigate the clinical significance of interleukin-17 (IL-17) in peripheral blood mononuclear cells (PBMC) of children with steroid-sensitive nephrotic syndrome (SSNS) and steroid-dependent nephritic syndrome (SDNS). Methods: 47 children with primary nephrotic syndrome (PNS), who were hospitalized in Guangzhou First Municipal People’s Hospital between January 2012 and March 2014 were recruited, including 20 with SSNS and 27 with SDNS. 20 healthy children were included as the control group. Venous blood of both groups were collected for the measuvemeat of serum albumin (ALB), total cholesterol (TC), triglyceride (TG), blood urea nitrogen (BUN), serum creatinine (Scr), serum and urinary β2-microglobulin (β2-MG) and 24h urinary protein quantitation were determined before and 4 weeks after the treatment, respectively. Enzyme linked immunosorbent assay was used to determine the concentration of IL-17 in PBMC of the medium supernatant under the stimulation of phytohemagglutinin (PHA).The correlation between IL-17 and 24h urinary protein was analyzed.Results:There were statistically significant differences in the levels of ALB, TC, TG, BUN, Scr, β2-MG and 24h urinary protein quantitation in SSNS group and SDNS group after the treatment compared with those before the treatment (P<0.05). However, no statistically significant differences were found in the parameters between the two groups. The IL-17 concentration in the two NS groups was significantly higher than that in the control group before the treatment (P<0.05), whereas the IL-17 concentration in the SDNS group was significantly higher than that in the SSNS group and control group after the treatment (P<0.05). Linear regression analysis showed that the IL-17 concentration was positively correlated with 24h urinary protein quantitation in the two groups before the treatment (r=0.949,P<0.01). And positive correlation was found in the decreasing value between IL-17 concentration and 24h urinary protein quantitation in SDNS group after the treatment (r=0.767,P<0.01). Conclusion: IL-17 has certain effects in the occurrence and development of PNS in children, which may be an important cause of SDNS in children. Then, the change of IL-17 could be a significant clinical index to investigate the efficacy of treating PNS children.

nephritic syndrome; interleukin-17; peripheral blood mononuclear cell

10.3969/j.issn.2095-9664.2015.01.007

詹俊琳(1979-)，女，本科，讲师。

R726.9

A

2095-9664(2015)01-0024-04

2014-06-23)

研究方向：肾小球病的发病机理。

*通讯作者:E-mail：yuli828@yeah.net