白冰珂，胡 燕，邬顺全，姜棋予，杨瑞创，柴燕涛，李瑞生，侯 俊

HAV属于小RNA病毒科嗜肝病毒属，其基因组为单股正链RNA，全长约7500个核苷酸。HAV开放读码框架编码一个大的前体蛋白，在病毒蛋白酶的作用下裂解产生11个不同大小的具有不同功能的蛋白，包括结构蛋白 VP1、VP2、VP3、VP4 以及非结构蛋白2A、2B、2C。一般HAV毒株在细胞培养中增殖缓慢，培养周期较长，为HAV灭活疫苗的生产带来不便。我们从一例甲型肝炎患者粪便中分离到1株HAV毒株，该病毒具有在细胞培养中快速增长的特性：其培养周期为13 d，而一般HAV在细胞中的生长周期为1个月。为了解其基因特点，为HAV疫苗生产打基础，本文参照文献报道方法，对HAV302株进行了基因分型并对其编码功能区序列进行分析[1-2]，现将结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 病毒和试剂 HAV302株病毒为本室分离鉴定，QIAamp®Viral RNA mini kit购自Qiagen公司（德国凯杰公司），反转录酶SuperscraptШ和Taq酶购自Invitrogen公司（美国英骏公司），T载体购自Promega公司（美国普洛麦格公司），其他试剂均为国产试剂。

1.2 病毒RNA的提取 用QIAamp®Viral RNA minikit提取病毒RNA，具体操作为：取140μl病毒培养液加入含carrierRNA的结合液AVL中，加入无水乙醇后过柱，用AW1、AW2溶液洗柱，14 000 r/m高速离心彻底去除乙醇，最后用洗脱液AVE洗脱病毒RNA。

1.3 反转录-聚合酶链反应（RT－PCR）

1.3.1 VP1/2A区段的 RT-PCR 取 2μl病毒RNA， 以 SuperscraptШ和 引 物 1 （序 列 ：5′-TTTTTTTTTTTTTGGTACCATTTACTGA）进行反转录扩增VP1/2A区段的168个核苷酸（上游引物：5′-GAATCAATGATGAGCAGA，下游引物：5′-AACCCCTTCATTTTCCTA），扩增条件为94℃，2min；94℃，30 s；47℃，30 s；72℃，30 s；扩增 40个循环。扩增产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定大小后进行序列测定。

1.3.2 2B/2C区段的RT-PCR 取2μl病毒RNA，以 SuperscraptШ和引物 1（序列：5′-TTTTTTTTTTTT TGGTACCATTTACTGA）进行反转录扩增2B/2C区段的1326个核苷酸（上游引物：5′-GGTGTTGGATTAATAGCAG，下游引物：5′-CTGAGACCACAACTCCATA），扩增条件为 94℃，2min；……