杨兴林，梁跃东，洪章萍，熊金凤，王云芬，姚 骏，黄 海

（1.贵州省贵阳市第五人民医院检验科 550004；2.贵阳医学院检验系，贵阳550004）

手足口病（hand foot and mouth disease，HFMD）是由多种人肠道病毒引起的一种儿童常见传染病，以发热和手、足、口腔等部位的皮疹或疱疹为主要症状。少数患者出现无菌性脑膜炎、脑炎、急性弛缓性麻痹、神经源性肺水肿和心肌炎等，个别重症患儿病情进展快，可导致死亡。能引起HFMD的病毒很多，主要为小RNA病毒科肠道病毒属的柯萨奇病毒、埃可病毒和新肠道病毒。其中，肠道病毒71型（EV71）和柯萨奇病毒A组16型（CA16）为目前引发HFMD的两大主要病原体。其中EV71感染约占实验室检测的61.43%，重症病例的88.00%，死亡病例的95.00%以上[1]。因此，对引起HFMD病原进行迅速鉴别诊断显得尤为重要。为了解贵阳地区HFMD的病原体构成，本研究运用荧光定量PCR方法对2012年1～12月，到贵州省贵阳市第五人民医院住院疑似HFMD患儿的肛拭子标本检测肠道病毒通用型、EV71和CA16，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 2012年1～12月，在贵阳市第五人民医院（贵阳市HFMD定点医院）住院治疗的HFMD患儿3 179例，年龄1个月至35岁，男1 724例，女1 455例。诊断标准参照均符合《诸福棠实用儿科学》HFMD诊断标准及《手足口病诊疗指南》（2010年版）HFMD的诊断标准。

1.2 方法

1.2.1 主要试剂和仪器 采用获国家注册证上海之江生物科技有限公司生产的EV71、CA16荧光定量PCR试剂和肠道病毒通用型荧光定量PCR试剂。检测仪器为罗氏Cobas z 480荧光定量PCR仪。

1.2.2 标本采集 在患儿住院当天用专用采样棉签，从患儿肛门轻轻插入，适度用力弧型左右擦拭数下，拔出后，迅速将棉签放入病毒采样管（北京友康基业生物科技有限公司）中，采样管外表贴上带有惟一识别号码的标签。于2h内送检，-80℃低温保存。

1.2.3 肠道病毒核酸PCR荧光检测 病毒RNA的提取，采用磁珠柱提取法，按照上海之江生物科技有限公司RNA抽提试剂盒说明书操作。扩增反应体系和条件按照说明书操作和设置，在罗氏Cobas z 480荧光定量PCR仪上进行检测。荧光通道检测选用FAM通道。结果判断：按照说明书，检测Ct≤38，检测结果报告为阳性，如果检测Ct值38～40，重复检测1次，如果重复检测Ct值仍在38～40，则判为阴性。试验结果解释见表1。

1.3 统计学处理 采用SPSS 13.0统计软件进行数据分析，对3 179例住院HFMD患儿运用描述性流行病学方法进行分析，计数资料采用χ2检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

表1 试验结果解释

2 结果

2.1 一般情况 3 179例HFMD感染者中，男女比例为1.18∶1.00，男童患病率高于女童（P＜0.05）；EV71、CA16和其他EV感染分别占10.41%（331／3 179）、4.75%（151／3 179）、28.22%（897／3 179），EV71＋CA16阳性7例占0.22%。男、女的EV71、其他型EV及EV71＋CA16检出率比较差异无统计学意义（P＞0.05），CA16检出率比较男性高于女性，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

表2 不同性别组患者肠道病毒检测[n（%）]

2.2 不同月份HFMD病例及病原检测情况 3 179例HFMD病例按照月份统计分析，HFMD全年均有发病，但有明显的季节性，随季节变换，呈单峰分布状态，在4～7月为发病高峰，10～11月出现一个次高峰。从4月份开始上升，5月份达到高峰，6月份以后呈逐渐下降趋势；10月份有轻微上升，11月份有一个小高峰。3 179例HFMD不同型病毒检出阳性率的变化趋势情况分析，全年各月份主要以其他型肠道病毒阳性率最高，其次为EV71、CA16。其变化趋势在2月份其他型肠道病毒、EV71、CA16形成一个交叉点，随着发病例数的增加，其他型肠道病毒检出阳性率逐渐增加，在5月份高峰后逐渐将低，在11月份小高峰时阳性率又达到最高。而EV71与CA16检测阳性率在1～5月变化不大，交替进行，6月以后EV71检测率逐渐升高，12月份检出率最高。其不同病毒型别变化趋势见图1。

图1 2012年3179例HFMD患者不同月份肠道病毒阳性率变化趋势

2.3 不同年龄段儿童病毒感染情况 本地区手足口病发病0～3岁患儿2 720例，占85.56%；＞3～5岁患儿337例，占10.6%；＞5岁患儿122例，占3.8%。主要以小于或等于3岁为高发年龄。不同年龄组的病原构成差异有统计学意义（P＜0.05），各年龄组患儿中，其他型肠道病毒感染所占比例均显著高于EV71和CA16。其他型肠道病毒0～1岁组感染阳性率最高31.01%，＞5岁组感染阳性率最低为15.58%，不同年龄组其他型EV感染率比较差异有统计学意义（P＜0.05）。而CA16与EV71在不同年龄段的检出率变化不大，其在不同年龄组比较差异无统计学意义（均P＞0.05）。见表3。

表3 不同年龄组患者肠道病毒检测[n（%）]

3 讨论

HFMD是由多种肠道病毒引起的常见传染病之一，引起HFMD的病毒属于小RNA病毒科肠道病毒属。其中以EV71及CVA16型较为常见。我国自1981年上海始见本病后，北京、福建、吉林等地陆续有相关报道。掌握不同时期及地域HFMD病原体流行特征和分布情况，对预测HFMD病原体流行趋势的变化具有重要的价值；故监测HFMD病原体变化对于HFMD预防、治疗以及预后的判断均具有重要意义。

本研究采用了经国家FDA注册批准的肠道病毒核酸检测系列试剂盒作为检测HFMD病原体的实验室核酸检测标准，以保证检测结果的准确性，运用一步法荧光定量PCR法原理对肠道病毒通用型、EV71型和CA16型进行检测。本研究共采集的贵阳地区3 179例HFMD患者肛拭子标本，检出EV71共331例（10.41%），CA16共151例（4.75%），其他肠道病毒共879例（28.22%），EV71＋CA16阳性7例（0.22%）。证实贵阳地区2012年手足口病流行的主要病原体是非EV71、非CA16的其他型肠道病毒感染，其次是EV71、CA16。其检测结果与作者之前的报道比较：2010年手足口病例共312例，EV71、CA16、其他肠道病毒的检出百分率分别为13.46%、6.73%、48.07%[2]；2011年检测的1 379份手足口EV71为5.80%及CA16为2.18%，其他型肠道病毒检出率为39.10%[3]。李家伟等[4]报道的2009年贵阳市重症患者EV71阳性的检出率为16.30%，其他肠道病毒的阳性率为26.08%。通过近几年贵阳地区手足口病病原检测结果分析其主要病原体还是以其他型肠道病毒为主，其次是EV71、CA16。而2012年的其他型肠道病毒的检出率有所降低，EV71与CA16检出率较2011年有所上升。本研究报道在主要病原体上与国内其他地区报道存在差异，林先耀等[5]报道杭州2012年449例HFMD临床诊断病例中，其中EV71占42.6%，CA16占22.9%，其他肠道病毒占4.6%。葛艳玲等[6]报道上海地区1 544例患儿病原学检测，EV7l阳性908例（58.81%），CA16阳性143例（9.26%）。李洪杰等[7]报道北京2010年EV71阳性标本占40.3%；CA16阳性标本占5.64%；其他未分型肠道病毒阳性标本占17.2%。常昭瑞等[8]对我国2008～2009年HFMD报告病例流行病学特征分析，表明EV71和CA16为主要病原，不同地区其病原构成不尽相同，不同纬度地区流行强度不同，季节分布存在差异。对于贵阳地区的手足口病其主要病原是其他血清型的肠道病毒感染，而在其他肠道病毒感染中有其优势型，其相关型别的鉴别工作正在进一步确认。

从本地区发病人群来看，本研究结果显示在各年龄段人群中均可发病，以5岁以下儿童为主，其中3岁及以下年龄组发病率最高，男童的发病率高于女童。其报道与国内相关报道相一致[9]。各年龄组患儿中，其他型肠道病毒感染所占比例均显著高于EV71和CA16。不同年龄组其他型肠道病毒感染率比较差异有统计学意义（P＜0.05），而CA16与EV71在不同年龄段的检出率差异无统计学意义（P＞0.05）。从本统计结果来看本地区发病年龄集中在2岁以下，Lu等[10]认为机体缺乏保护性抗体可能是低年龄组儿童高发及高病死率的主要原因。人对肠道病毒普遍易感，HFMD传播途径容易实现，不仅经粪-口传播，也可经空气或接触等传染途径传播，卫生条件、人口密集程度等因素影响发病[11]，因此，家长在照顾其小孩时需要注意卫生。流行季节分布显示，3月病例开始增多，4～7月为发病高峰，10～11月出现一个次高峰，与我国台湾、香港和新加坡等地报道的流行季节发病高峰（5～7月）相比提前了1个月[12]。在4～7月病原构成主要以其他型肠道病毒为主，10～11月EV71逐渐升高。本地区流行高峰持续时间长，可能与低纬度地区存在适宜病毒存活和传播的地理气候条件有关[13]。

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