姚晓敏，倪铭，李越，魏玲，林爱斌，李宏伟(浙江医药高等专科学校，浙江宁波 3500；北京市理化分析测试中心)



橙皮苷对四环素所致小鼠脂肪肝的保护作用

姚晓敏1，倪铭1，李越2，魏玲2，林爱斌1，李宏伟1(1浙江医药高等专科学校，浙江宁波 315100；2北京市理化分析测试中心)

摘要：目的观察橙皮苷对四环素引起小鼠非酒精性脂肪肝的保护作用。方法将ICR小鼠分为A、B、C组，A组给予橙皮苷(300 mg/kg)连续灌胃10 d，B、C组给予同体积溶剂；在第10天给药后1 h时A、B组腹腔注射四环素200 mg/kg 20 mL，C组给予相同pH值等体积生理盐水。给毒后24 h眼球取血，并取肝脏，检测血清ALT、AST、TG、TC及肝组织TG、TC、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酯(SOD)、谷胱甘肽(GSH)，HE染色观察肝脏组织病理学改变。结果与C组比较，B组血清ALT、AST升高而TG、TC降低，肝组织中TG、TC、MDA、GSH升高，P均<0.05；与B组比较，A组血清ALT、AST降低而TG、TC升高，肝组织中TG、TC降低而GSH升高，P均<0.05。C组小鼠肝脏未见明显病变，B组动物肝脏的中央静脉和小叶间静脉周围出现肝细胞肿胀、水样变性等病理改变。A组给药可减轻上述病理改变。结论橙皮苷对四环素所致小鼠脂肪肝具有明显的保护作用。

关键词：非酒精性脂肪肝；橙皮苷；四环素；甘油三酯；胆固醇

研究发现，非酒精性脂肪肝(NAFLD)患病率在迅速增加，已成为一个世界性的公共卫生问题[1]；其常见病因有肥胖、糖尿病、化学毒物和药物等[2～6]，但发病机制尚不十分清楚，且无疗效确切的治疗药物。橙皮苷是橙皮素与芸香糖形成的糖苷，广泛存在于豆科、唇形花科、碟形花科、芸香科、柑橘属植物中。2013年9月～2014年2月，我们观察了橙皮苷对四环素所致小鼠NAFLD是否有保护作用，为橙皮苷的临床应用提供实验依据。

1材料与方法

1.1材料实验动物：ICR小鼠30只，雄性，体质量20～22 g，SPF级，购自北京维通利华实验动物技术公司；实验期间饲养于屏蔽级动物房，每日明暗室各12 h，恒温恒湿，标准饲料，自由饮水。药品和试剂：盐酸四环素(CAS)购自Ameresco公司，ALT、AST、TG、TC、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽(GSH)测定试剂盒均购自南京建成生物工程研究所；橙皮苷(95%)购自南京泽朗医药科技有限公司，联苯双酯滴丸(批号：13010104)购自北京市地坛医院；其他试剂均为分析纯化学试剂。实验仪器：电子显微镜(80i，Nikon)，超声波清洗器(SB25-120，宁波新芝生物科技)，匀浆机(IKA T10，basic)，加热制冷水浴槽(GD120-S12，Grant)，电子天平(LA5002，上海精天电子仪器公司)，多功能酶标仪(varianscan Flash，Thermo)，超级恒温水浴锅(HH601，金坛科兴)，酸度计(PHS-3C，上海精密科学仪器厂)，高速离心机(TGL-16B，上海安亭科学仪器厂)。

1.2方法

1.2.1动物分组与造模小鼠随机分为A、B、C组各10只，A组给予橙皮苷(300 mg/kg)连续灌胃10 d，B、C组给予同体积溶剂；在第10天给药后1 h时，A、B组腹腔注射四环素200 mg/kg 20 mL，C组给予相同pH值等体积生理盐水。给毒后24 h眼球取血，并取肝脏进行检测。

1.2.2血清ALT、AST、TG、TC测定小鼠腹腔注射四环素后24 h眼球取血，3 500 r/min离心10min，分离血清，检测血清ALT、AST、TG、TC。

1.2.3肝组织TG、TC测定小鼠眼球取血后取肝脏，取同一部位肝组织；于冰浴上以无水乙醇制成10%肝匀浆，2 500 r/min离心10 min；取上清液，按试剂盒说明测定肝组织中的TG、TC。

1.2.4肝组织MDA、SOD、GSH测定取同一部位肝组织，于冰浴上以生理盐水制成10%肝匀浆，根据试剂盒说明测定肝组织中的MDA、GSH、SOD。

1.2.5肝组织病理学观察取肝脏大叶同一部位组织，以10%甲醛固定；HE染色后，显微镜下观察肝细胞是否出现坏死、水样变变性，脂肪样变性，炎性细胞浸润等。

2结果

2.1各组小鼠血清ALT、AST、TG、TC比较见表1。

组别ALT(U/L)AST(U/L)TC(mg/dL)TG(mg/dL)A组23.28±6.22#30.13±4.62#140.26±17.56#88.50±44.83#B组49.07±16.20*38.68±5.41*111.32±24.52*37.86±19.06*C组12.80±2.3826.27±7.02189.36±32.41106.12±19.01

注：与C组比较，*P<0.01；与B组比较，#P<0.05。

2.2各组小鼠肝组织中TC、TG比较见表2。

组别TC(mmol/g)TG(mmol/g)A组29.16±7.69##179.61±51.94#B组43.09±5.55*263.12±51.34*C组33.23±2.99106.00±15.70

注：与C组比较，*P<0.01；与B组比较，#P<0.05,##P<0.01。

2.3各组小鼠肝组织中MDA、SOD、GSH比较见表3。

表3　各组小鼠肝组织中MDA、SOD、GSH

注：与C组比较，*P<0.01；与B组比较，#P<0.01。

2.4各组小鼠肝脏组织形态学改变C组小鼠肝脏未见明显病变，B组动物肝脏的中央静脉和小叶间静脉周围出现肝细胞肿胀、水样变性等病理改变，A组给药可减轻上述病理改变。见插页Ⅲ图6。

3讨论

橙皮苷分子结构中含有多个羟基，有酸性，有亲水性，属黄酮物质的黄烷酮。近年来，发现其具有抗氧化、抗过敏、降低胆固醇、保肝、降血压、抗肿瘤等药理作用[6～8]，还能清除生物体的自由基，提高机体免疫力。李慧等[9]研究发现，橙皮苷能极显著地降低蛋黄乳所致高脂血症小鼠血清TC、TG、LDL-C水平，并能升高HDL-C。因此，橙皮苷具有显著的降血脂作用。但是，橙皮苷对四环素所致NAFLD的作用尚未见报道。

四环素是引起NAFLD的药物之一，可诱发小泡性脂肪肝。其发生机制主要是损伤线粒体脂肪酸β氧化，降低微粒体甘油三酯转移蛋白活性，从而抑制肝脏极低密度脂蛋白(VLDL)释放[10，11]。本研究结果显示，单剂量四环素小鼠腹腔注射能够引起肝脏脂肪变性，表现为血清AST和ALT明显升高、TC和TG显著降低，肝组织脂质TC和TG明显聚积，肝细胞出现小泡性脂质聚集、水样变性和坏死，上述结果均可反映四环素诱导小鼠出现脂肪肝的早期变化。而橙皮苷预防给药能抑制四环素所致小鼠血清ALT和AST水平升高、调节降低的TG和TC浓度、抑制肝脏TG和TC的蓄积，改善肝脏组织病理学损伤，从而保护四环素所引起的NAFLD。

本研究结果显示，小鼠腹腔注射四环素后肝组织脂质过氧化产物MDA明显增多，抗氧化物GSH含量出现升高，可考虑为抗氧化物的升高属于代偿性，以利于自由基清除。而橙皮苷预防给药对MDA增多的抑制不明显，但是可进一步升高抗氧化物GSH水平。由此推测，橙皮苷保护四环素引起小鼠脂肪肝部分与其抗氧化作用相关。

参考文献：

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(收稿日期：2014-08-21)

中图分类号：R963

文献标志码：A

文章编号：1002-266X(2015)04-0028-02

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.04.010

基金项目：浙江省教育厅科研项目(Y201122579)；浙江医药高等专科学校2011年度重点课题项目(ZPCSR2011001)；浙江省大学生科技创新项目(2014R433004)；浙江省宁波市自然科学基金项目(2012A610 245)。