张涤，杨东娜 (沈阳市第五人民医院，沈阳110023)

尤瑞克林对大鼠脑I/R后大脑皮层细胞凋亡及凋亡相关蛋白表达的影响

张涤，杨东娜 (沈阳市第五人民医院，沈阳110023)

摘要：目的观察尤瑞克林对大鼠局灶性脑缺血再灌注(I/R)后不同时间点大脑皮层细胞凋亡及Caspase-3、Bcl-2蛋白表达的影响。方法84只SD雄性大鼠随机分为假手术组，模型1、2、3组及尤瑞克林1、2、3组，各12只。各模型组及尤瑞克林组采用线栓法制作大脑中动脉闭塞(MCAO)模型；假手术组只分离、暴露血管，不结扎血管，不插入尼龙鱼线；尤瑞克林1、2、3组在造模后30 min舌下静脉注射尤瑞克林。模型1、2、3组及尤瑞克林1、2、3组分别于缺血后6、12、48 h小心向外拉鱼线约1 cm使其断端回至颈外动脉内，形成再灌注。对各组大鼠行Zea Longa神经缺损功能评分，以1～3分判定为模型制作成功。每组各取2只大鼠于再灌注24 h采用TUNEL法检测细胞凋亡情况，剩余10只采用免疫组化法检测脑组织Caspase-3、Bcl-2蛋白。结果与假手术组相比，模型组及尤瑞克林组大脑皮层细胞凋亡率及脑组织Caspase-3表达增高，Bcl-2表达降低(P均<0.05)；其中，尤瑞克林1、2、3组Caspase-3表达低于模型1、2、3组(P<0.05)，尤瑞克林2、3组Bcl-2表达高于模型2、3组。结论尤瑞克林可抑制局灶性脑缺血再灌注大鼠大脑皮层细胞凋亡；该作用可能是通过下调Caspase-3表达、上调Bcl-2表达而实现的。

关键词：尤瑞克林；缺血再灌注损伤；细胞凋亡；含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-3；B淋巴细胞瘤-2基因；大鼠

缺血性脑卒中发病率高，同时有较高的致残率及病死率，目前治疗急性期缺血性脑卒中最有效的方法是溶栓治疗，但其仅用于发病时间较早的患者，很多患者错失了最佳溶栓时间。尤瑞克林是治疗缺血性脑卒中的一种新药，因其安全性、有效率高，不良反应少，得到了广泛认可[1]。2012年3～9月，本研究制备了局灶性缺血性脑卒中大鼠模型，观察尤瑞克林对大脑皮层细胞凋亡及凋亡相关蛋白表达的影响。现报告如下。

1材料与方法

1.1试剂与仪器10%水合氯醛，氯化红四氮唑(TTC)，Caspase-3 mRNA原位杂交试剂盒，Bcl-2检测试剂盒，4%多聚甲醛，TUNEL凋亡检测试剂盒，DAB显色液，图像分析仪(HMIAS-2000医学图文分析系统)，生物显微镜(Olympus CX31)。

1.2动物分组与处理SD雄性大鼠84只，体质量240～280 g，鼠龄3～4个月。随机分为假手术组，模型1、2、3组及尤瑞克林1、2、3组，各12只。各模型组及尤瑞克林组采用改良的Zea Longa线栓法制备大脑中动脉闭塞(MCAO)模型[2,3]，大鼠术前禁食12 h，不禁水，称重后予10%水合氯醛0.3 mL/100 g腹腔注射麻醉，取仰卧位固定，常规备皮消毒，颈正中切口，分离右侧颈总动脉(CCA)、颈外动脉(ECA)、颈内动脉(ICA)及迷走神经，结扎ECA，于颈总动脉分叉下方剪一切口，将一根长5.0 cm、直径约0.23 mm的制备好的圆头鱼线从小口插入，插入深度距颈内外动脉分叉处16～18 mm，直至有轻微阻力感为止，用线扎紧固定栓线，然后缝合肌肉皮肤，在栓线尾端外露部分作标记。假手术组鱼线置入颈内动脉10 mm即可，余步骤同模型组。各组均在术后1～2 h大鼠清醒时行神经功能评分。尤瑞克林各组在造模后30 min按8.75×10-3PNA单位/kg舌下静脉注射给药。术后用庆大霉素注射液冲洗创口后逐层缝合，栓线尾端外露部分标记，放回笼子内单笼饲养。模型1、2、3组及尤瑞克林1、2、3组分别于缺血后6、12、48 h小心外拉栓线约1 cm使其断端头部回至ECA内，形成再灌注。对大鼠进行Zea Longa神经缺损功能评分[4]，无神经系统损伤体征计0分，不能完全伸展右侧前爪计1分，行走时向右侧转圈计2分，站立不稳、向右侧倾倒计3分，不能自发行走、意识丧失计4分；以1～3分判定为模型制作成功，如实验中有死亡大鼠，取同批次的大鼠补足。

1.3细胞凋亡检测每组大鼠各取2只于再灌注24 h予水合氯醛麻醉，打开胸腔，完全暴露大鼠心脏，由左心室插入20号针头，剪开右心耳，灌注生理盐水，见大鼠四肢、眼睛、口唇黏膜逐渐变为白色、右心耳流出澄清液体后，用4%多聚甲醛250 mL灌注固定，可见灌注过程中大鼠四肢及头尾逐渐僵硬。在5 min内取脑，去掉小脑、低位脑干和前部嗅球，取部分放入新鲜配置的4%多聚甲醛中固定至少24 h，常规乙醇梯度脱水，二甲苯透明后石蜡包埋，做连续冠状切片，厚约7 μm。每只鼠取2张脑组织切片，采用TUNEL法检测细胞凋亡，计数凋亡细胞。

1.4脑组织中Caspase-3、Bcl-2表达检测取各组剩余10只大鼠，取材同前，并石蜡切片常规脱蜡后，采用免疫组化法检测脑组织中的Caspase-3、Bcl-2。光镜下观察，胞质被染成棕褐色为阳性细胞。用MetaMorph显微图像分析系统测定额顶叶皮质神经细胞胞质的灰度值，染色越深，其值越小，代表蛋白表达越高；每张切片随机选择5个视野，取均值。

2结果

造模后3只大鼠死亡，2只神经功能评分为1分，剔除，取同批次造模成功及神经功能评分合格的大鼠补齐。随着再灌注时间延长，尤瑞克林组与模型组大脑皮层细胞凋亡率增高，脑组织中Caspase-3表达上调，Bcl-2表达下调；与假手术组相比，模型组及尤瑞克林组大脑皮层细胞凋亡率及脑组织中Caspase-3表达增高，Bcl-2表达减弱(P均<0.05)；尤瑞克林2、3组细胞凋亡率低于模型2、3组，尤瑞克林1、2、3组Caspase-3表达低于模型1、2、3组，尤瑞克林2、3组Bcl-2表达高于模型2、3组(P均<0.05)。见表1。

表1　各组大鼠大脑皮层细胞凋亡率及脑组织中Caspase-3、

注：与假手术组比较，*P<0．05；与相应模型组比较，#P<0．05。

3讨论

缺血性脑卒中目前已成为影响我国居民健康的重要疾病之一。脑缺血后再灌注可能通过触发一系列的复杂的级联反应, 包括线粒体损伤、钙超载、兴奋性氨酸毒性作用、自由基生成、蛋白酶激活和炎症反应等, 这些因素导致细胞死亡或凋亡。保护凋亡细胞周围缺血半暗带的神经细胞，抑制细胞凋亡的发生，是缺血性脑损伤治疗的重点[5～7]。目前临床上有确切疗效的治疗急性缺血性脑卒中的药物并不多。尤瑞克林即人尿激肽原酶，是从健康男性尿中提取的一种由238个氨基酸组成的丝氨酸蛋白酶[8,9]。尤瑞克林作用于激肽原后形成胰激肽，后者及其进一步降解产物能与缺血部位血管细胞产生的B1受体结合发挥扩张微动脉的作用。因B1受体仅在组织受缺血损伤后由损伤的组织血管内皮细胞诱导生成，故尤瑞克林可选择性地扩张缺血区脑血管，从而提高缺血部位脑组织血流量，改善脑组织对葡萄糖及氧的摄取[10,11]。同时，尤瑞克林还能减轻神经细胞损伤，抑制神经细胞凋亡，促进内源性神经再生；随着用药时间延长，还有促进新生血管形成、内源性神经细胞再生的作用，进一步加速神经功能的恢复[12,13]。本研究发现，随着再灌注时间延长，尤瑞克林组与模型组大脑皮层细胞凋亡率呈上升趋势，均高于假手术组，且尤瑞克林组细胞凋亡率低于模型组，表明以尤瑞克林处理脑缺血再灌注大鼠模型，可延缓大鼠大脑皮层细胞凋亡，保护脑组织。

很多蛋白分子参与了神经细胞的凋亡，其中Caspase-3及Bcl-2在细胞凋亡过程中发挥重要作用。Caspase在正常状态下以无活性酶原形式存在，当凋亡信号刺激其特异Asp残基被剪切后激活，同时释放N端结构域。Caspase按次序激活其下游分子，形成Caspase级联反应，将凋亡信号级级传至凋亡底物。Caspase-3被认为是细胞凋亡蛋白级联反应的必经之路。Caspase-3能裂解DNA修复相关分子，促使细胞凋亡[14，15]。Bcl-2是从小鼠B淋巴细胞瘤中分离得到的原癌基因，是细胞凋亡最重要的一组调节基因，可抑制多种刺激导致的易损神经元凋亡[16]。本研究结果显示，与假手术组相比，模型组及尤瑞克林组脑组织中Caspase-3表达增高，Bcl-2表达降低，且尤瑞克林组Caspase-3表达低于模型组，Bcl-2表达高于模型组，提示尤瑞克林可能是通过抑制Caspase-3表达、上调Bcl-2表达，从而起到抑制神经细胞凋亡的作用。

综上，本研究证实，大鼠大脑发生缺血再灌注损伤后，予尤瑞克林处理可降低大脑皮层细胞凋亡率，减轻缺血再灌注脑损伤，保护神经功能，其机制可能与调节凋亡相关蛋白表达有关。

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(收稿日期：2014-09-24)

中图分类号：R33

文献标志码：A

文章编号：1002-266X(2015)02-0027-03

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2015.02.009