王化修，田道法，吴新正，吕小元，孙剑光( 邵阳医学高等专科学校,湖南邵阳4000； 湖南中医药大学； 湖南省第二人民医院)

鼻咽癌癌前病变小鼠鼻咽黏膜上皮组织Cx43、Cx32、Cx26的表达变化

王化修1，田道法2，吴新正3，吕小元1，孙剑光1(1 邵阳医学高等专科学校,湖南邵阳422000；2 湖南中医药大学；3 湖南省第二人民医院)

摘要：目的观察鼻咽癌癌前病变小鼠鼻咽黏膜上皮组织间隙连接蛋白(Cx)43、32、26及其mRNA的表达变化。方法 TgN(p53mt-LMP1)/HT转基因阳性小鼠(转基因组) 、同品系C57BL/6J野生小鼠(野生组)各36只，其中每组12、15、18月龄各12只。取小鼠鼻咽黏膜组织，采用免疫组化法、Western blot法检测鼻咽黏膜上皮中的Cx43、Cx32、Cx26蛋白；RT-PCR法检测Cx43、Cx32、Cx26 mRNA。结果 转基因组各月龄小鼠鼻咽黏膜上皮中Cx43、Cx32、Cx26 mRNA及其蛋白相对表达量均低于野生组；转基因组内，15、18月龄小鼠Cx43、Cx32、Cx26 mRNA及其蛋白相对表达量低于12月龄小鼠(P均<0.05)。结论鼻咽癌癌前病变小鼠鼻咽黏膜上皮中Cx43、Cx32、Cx26 mRNA及其蛋白表达水平下降，其可能与鼻咽癌癌前病变的发生有关。

关键词：鼻咽癌；癌前病变；转基因鼠；间隙连接蛋白

研究表明，细胞间隙连接通讯(GJIC)功能缺陷、间隙连接蛋白(Cx)异常表达与多数肿瘤的恶性增殖有关[1～5]，GJIC异常可能是细胞癌变的重要机制之一。Cx的快速构象变化及翻译后化学修饰(磷酸化作用)、细胞质中Cx池与细胞表面的黏附分子等可直接或间接影响GJIC的功能。2012年6月～2013年12月，我们制作了鼻咽癌癌前病变小鼠模型，观察鼻咽黏膜上皮组织Cx43、Cx32、Cx26 mRNA及其蛋白的表达变化，并探讨其意义。

1材料与方法

1.1实验动物与处理G10代TgN(p53mt-LMP1)/HT转基因阳性小鼠36只(转基因组)为本课题组制备和繁殖[6]，12、15、18个月龄各12只，雌雄各半。同品系同龄C57BL/6J健康野生小鼠36只(野生组)购自中国医学科学院实验动物研究所，12、15、18个月各12只雌雄各半。小鼠饲养于IVC 独立送风笼具，室温(23±1)℃，湿度50%±10%，采用12 h∶12 h明暗光照。处死小鼠，取小鼠鼻咽黏膜上皮组织，每一标本分为两份，一份用液氮速冻后存入-70 ℃低温冰箱待Western blot、RT-PCR检测；另一份以4%多聚甲醛固定，脱水后石蜡包埋供病理组织学检查及免疫组化检测。

1.2检测项目

1.2.1鼻咽黏膜上皮组织Cx43、Cx32、Cx26表达①免疫组化法：根据病理组织学观察所示，选取典型病变标本4 μm厚连续切片，采用免疫组化SP法检测Cx43、Cx32、Cx26蛋白；着色部位在细胞质，少数在细胞膜，每张切片在光镜下随机观察5个高倍视野，各计数100个细胞，计算阳性细胞百分比；阳性细胞百分比<5%计0分，5%～25%计1分，26%～50%计2分，51%～75%计3分，75%以上计4分；按染色强度计分，无着色计0分，浅黄色计1分，棕黄色计2分；两者乘积为0为阴性，≥1为阳性。②Western blot法：取出冻存的鼻咽黏膜组织标本，按试剂盒说明书操作，Image proplus6.0图像分析软件测算电泳条带的光密度值(OD值)，以β-actin作为内参，计算相对表达量。

1.2.2鼻咽黏膜上皮组织Cx43、Cx32、Cx26 mRNA表达采用RT-PCR法。用Trizol试剂提取总RNA。引物设计由上海生工生物工程有限公司完成(引物序列及目标片段长度见表1)。PCR反应体系：反应总体积25 μL包括cDNA第一链 2 μL，P1及P2引物1 μL，2 mmol/L dNTP 2 μL，10×PCR 反应缓冲液2.5 μL，2.5 mmol/L MgCl22 μL，5 U/μL Taq DNA聚合酶0.25 μL。反应条件：94 ℃预变性3 min，94 ℃变性30 s，52 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共进行32个循环后，以72 ℃延伸10 min。PCR扩增产物行0.1 μg/mL EB、20 g/L琼脂糖电泳，天能凝胶成像仪摄片。用Image proplus6.0图像分析软件测算电泳条带的OD值，计算相对表达量。

表1　Cx43、Cx32、Cx26 mRNA引物序列及目的片段长度

2结果

2.1鼻咽黏膜上皮组织Cx43、Cx32、Cx26蛋白表达转基因组各月龄小鼠Cx43、Cx32、Cx26蛋白相对表达量均低于野生组；转基因组内，15、18月龄小鼠Cx43、Cx32、Cx26蛋白相对表达量低于12月龄小鼠(P均<0.05)。见表2。

表2　各组小鼠鼻咽黏膜上皮组织Cx43、Cx32、

注：与同月龄野生组相比，△P<0.05；与同组12月龄小鼠相比，*P<0.05。

2.2鼻咽黏膜上皮组织Cx43、Cx32、Cx26 mRNA表达转基因组各月龄小鼠Cx43、Cx32、Cx26 mRNA相对表达量均低于野生组；转基因组内，15、18月龄小鼠Cx43、Cx32、Cx26 mRNA相对表达量低于12月龄小鼠(P均<0.05)。见表3。

表3　各组小鼠鼻咽黏膜上皮组织Cx43、Cx32、

注：与同月龄野生组相比，△P<0.05；与同组12月龄小鼠相比，*P<0.05。

3讨论

细胞间的GJIC功能被认为在控制细胞生长和保持细胞数量稳态方面具有重要作用。GJIC的结构基础为间隙连接(GJ)。GJ是一类形成于相邻细胞间的连接复合体，其结构单位是连接子，每个连接子由6个呈哑铃状的蛋白亚单位即Cx聚集而成[7～9]。肿瘤细胞GJIC功能的缺失伴随特定组织Cx基因表达下调；相反，当Cx基因表达上调时，将抑制肿瘤细胞生长。

Cx43是Cx基因家族中数量最为丰富的成员[10]。研究发现，Cx43的表达强度与细胞增殖活性呈负相关，Cx43表达不足，细胞间的信息交流减弱或被阻断，细胞丧失接触抑制，出现恶性增殖。文献报道，多种肿瘤如神经胶质瘤、肺癌、乳腺癌、肾癌、胃癌、前列腺癌、皮肤癌、卵巢癌、宫颈癌、喉癌等组织中均存在Cx43表达减少或缺失[11]。Cx26于核糖体合成，定位于细胞膜，形成六聚体，经半通道对接偶合组成完整的间隙连接，发挥间隙通信功能[12]。有学者将Cx26基因转入Cx26基因表达下调或缺失的肝癌细胞，Cx26蛋白表达恢复，正常的GJIC得到重建，肿瘤细胞生长受到抑制，并出现细胞分化现象，肝癌细胞恶性表型在一定程度上得到逆转[13]。研究发现，在肿瘤发生过程中，Cx32基因表达下调的发生早于Cx26基因[14]，提示Cx26与Cx32基因在肝癌的发生过程中作用不尽相同。Moennikea等[15]建立了Cx32基因缺陷的小鼠模型，发现这类小鼠肝脏再生能力降低，在化学诱变剂作用下易发生肝癌。有研究表明[16]，鼻咽癌细胞中Cx43、Cx45、Cx32、Cx26等连接蛋白表达明显下调或缺失，可能与翻译后Cx的磷酸化有关。当Cx无法聚集在质膜上时，细胞功能性间隙连接结构的形成受阻，导致鼻咽黏膜细胞间失去广泛通讯，细胞逃避正常的生长调控，最终导致鼻咽癌的发生。

本研究转基因组入选小鼠为本课题组前期制备的TgN(p53mt-LMP1)/HT模型鼠，其具有明确的鼻咽上皮细胞转化特征，系鼻咽癌癌前病变小鼠模型，本研究结果显示，转基因组各月龄小鼠鼻咽黏膜上皮中Cx43、Cx32、Cx26 mRNA及其蛋白相对表达量均低于野生组，且转基因组15、18月龄小鼠目标蛋白及基因表达量低于12月龄小鼠。这表明鼻咽癌癌前病变小鼠的鼻咽黏膜上皮中Cx43、Cx32、Cx26 mRNA转录活性降低，相应蛋白表达下调，且随着月龄增长，可能呈现下降趋势。上述变化使间隙连接通道不能完成正常组装，使GJIC功能缺陷，细胞增殖、凋亡调控信号的传递失控，在导致细胞过度增殖与异常分化的同时，细胞凋亡受到抑制而形成鼻咽癌癌前病变，并可能进一步发展为浸润癌。

结合上述结果，我们认为，Cx基因及蛋白表达下调、GJIC功能缺陷可能与鼻咽黏膜上皮癌前病变的发生有关，但具体机制仍需进一步研究。

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(收稿日期：2014-10-19)

基金项目：湖南省教育厅科学研究项目(12C1216)。

中图分类号：R739.63

文献标志码：A

文章编号：1002-266X(2015)02-0029-03

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2015.02.010