岳 磊，张 垚，马 卓

(哈尔滨工业大学 生命科学与技术学院，哈尔滨 150080)

激光扫描共聚焦显微镜实验技术与应用

岳 磊，张 垚，马 卓

(哈尔滨工业大学 生命科学与技术学院，哈尔滨 150080)

介绍了激光扫描共聚焦显微镜的工作原理、常规样品制备要求，以及图像获取的基本方法，包括光路设置及光强度调节、针孔的调节、增益值的调节、透射光路及DIC设置等.在此基础上，进一步介绍了共聚焦在生物学研究领域上的应用技巧，如多通道荧光采集、多层扫描及三维构建、荧光共定位及强度分析、时间序列扫描及光漂白技术，为快速掌握共聚焦的操作技巧提供有力的技术参考.

激光扫描共聚焦显微镜；图像；应用

激光扫描共聚焦显微镜(Laser Scanning Confocal Microscope，LSCM)是20世纪80年代发展起来的一项具有划时代意义的高科技新产品，是当今分子生物学和生命科学重要的分析仪器之一[1].它是在荧光显微镜成像基础上加装了激光扫描装置，利用计算机进行图像处理，从而得到细胞或组织内部微细结构的荧光图像，在亚细胞水平上观察诸多生理信号机细胞形态的变化，成为形态学、分子细胞生物学、神经科学、药理学、遗传学等科学领域中强有力的研究工具[2].如何运用共聚焦拍摄出清晰的信号图像，对于一些初次接触共聚焦的科研人员会有些无从入手，本文通过介绍共聚焦的操作技巧以及在生物学上的应用技术，对初学人员提供快速有效的应用参考.

1 仪器介绍

仪器型号：Zeiss LSCM510

主要技术参数：4种激光器：He-Ne 激光器 激发波长633 nm；He-Ne 激光器 激发波长543 nm；Ar多线激光器 激发波长458/488/514 nm；Diode 固体激光器 激发波长405 nm.5种可选物镜：10X，20X，40Xoil，63Xoil，100Xoil，每个物镜都有Plus-DIC功能.

2 基本原理

Confocal 利用放置在光源后的照明针孔和放置在检测器前的探测针孔实现点照明和点探测，来自光源的光通过照明针孔发射出的光聚焦在样品焦平面的某个点上，该点所发射的荧光成像在探测针孔上，该点以外的任何发射光均被探测针孔阻挡[3-4].照明针孔与探测针孔对被照射点或被探测点来说是共轭的，因此被探测点即共焦点，被探测点所在的平面即共焦平面.计算机以像点的方式将被探测点显示在计算机屏幕上，为了产生一幅完整的图像，由光路中的扫描系统在样品焦平面上扫描，从而产生一幅完整的共焦图像.只要载物台沿着Z轴上下移动，将样品新的一个层面移动到共焦平面上，样品的新层面又成像在显示器上，随着Z轴的不断移动，就可得到样品不同层面连续的光切图像[5].

3 常规样品制备要求

3.1 染料的选择

由于共聚焦是以单一波长的激光作为光源，因此在选择荧光染料时要根据仪器配备的激光器波长选择，如果在同一样品中有多种荧光染料标记，还要考虑它们的发射波长尽量不要重叠，避免串色问题[6].

3.2 样品承载物的选择

一般的共聚焦高倍物镜均为油镜，它的数值孔径较小，要求镜头与样品之间的工作距离不大于0.17 mm，因此如果观察样品为贴壁细胞或组织切片，可以用普通的载玻片和盖玻片即可.如果是悬浮细胞或悬浮粒子，可以用共聚焦专用的培养皿(glass bottom)承载样品进行观察[7].

3.3 封片剂的选择

如果样品只需要观测一次并且不是极易淬灭的荧光，可以选用一定浓度的甘油混合液封片即可.如果样品需要放置一段时间并多次拍摄，应选用抗荧光淬灭的封片剂，以减少荧光信号丢失[8].

4 图像获取的基本方法

4.1 光路设置及光强度调节

根据样品结合的荧光探针种类来选择相应的激光器(即发射波长)，如果样品为多种荧光染色，建议使用Multi Track模式进行信号采集，以避免串色问题.有些荧光染料发射波段比较宽，当与其他染料在同一样品中时，多通道采集也会串色，这时可以考虑将发射波段的滤片由长通(LP)调整为带通(BP)，或者进一步选用特征光谱曲线(Spectra)进行扫描[9].

激光强度越高，样品的信号越强，但荧光也容易淬灭或漂白；如果激光强度过低，信号采集时过多地增大Gain值，就会噪音点增多，影响图像质量，或者采集不到较弱的信号.随着激光管使用寿命的增加，激光的亮度会有所下降，原则上激光强度越低越好.

4.2 针孔(Pinhole)的调节

针孔直径的大小决定了采集的荧光信号多少及切片的厚度，针孔越大，获得的荧光信号越多，切片的厚度越大，同时获得的非焦平面的信号也增多，背景较高.因此，在保证图片质量的前提下，针孔直径越小越好，以提高图像分辨率.

4.3 增益值(Gain)的调节

增益值大小的调节相当于调节光电倍增管(PMT)的电压值，该值的大小直接决定了获得荧光信号的多少.Gain值越大，荧光强度越大，图像亮度越高，同时噪音点也增多.

4.4 背景扣除(Offset)的调节

在采集图像时，可以适当调节Offset键，扣除背景的荧光亮度，该值通常设置在0以下.Offset与Gain相辅相成，在实际操作中，二者要结合调节，增加Gain值，噪音点增多时，可以降低Offset值，提高图像质量.

4.5 图像扫描

用低像素预览，高像素获取图像.像素是指基本原色素及其灰度的基本编码，像素越高，分辨率越高，图像越清晰，反之亦然[10].要获取高清图像，不但可以通过提高像素的方法，还可以采用增加扫描次数的模式，更好的减少噪音点和背景.但是扫描次数越多，扫描速度越慢，容易造成荧光淬灭和弱信号丢失，通常扫描次数可以选择2～4次.

4.6 透射光路及DIC(微分干涉差)设置

共聚焦的透射光图像也是以激光为光源，由PMT将光信号转换成电信号，获取图像，图像颜色为伪彩.DIC(Differential Interference Contrast)原理是利用平面偏振光，可使样品厚度的微小差异转变为细微明暗差别，增强立体感，通常用于观察细胞的整体轮廓，便于荧光定位[11-12].共聚焦采集的DIC 图像为非共焦图像，因此在透射光通道无法对样品进行光学切片.

5 激光扫描共聚焦显微镜的在生物学研究中的应用技巧

5.1 多通道荧光及透射光叠加图像

采用Multi Track模式可以进行多种荧光及透射光图像扫描并叠加，选用不同颜色区分不同的荧光染料(如图1).叠加后的图片能更直观地观察不同荧光信号在生物体内的定性及共定位情况.

图1 多通道荧光及透射光叠加图像

5.2 Z轴扫描及三维构建

利用共聚焦可以去除非焦平面杂散光的特性，可以将较厚的样品进行多层扫描及三维构建.在获取模式下选择Z-stack，然后在Z轴方向选择起始层面和终止层面，再根据样品的厚度及实验需求选择扫描的层数(keep slice)，或者选择Z轴步进值(keep interval).通常步进值为切片厚度的50%可以获得较高的轴向分辨率[13].如图2所示.

图2 三维构建图像

5.3 双色荧光共定位分析

在多通道荧光叠加图像上，通过Histo模式下的Colocalisation功能，可以对多种荧光信号进行两两共定位分析，共定位的部分可以选用另一种颜色标记出来，获得的图像及谱图能更直观清晰的进行荧光信号的定性定量分析.如图3所示.

图3 双色荧光共定位分析图像

5.4 荧光强度对比分析

在Profile模式下选定某一区域或一条直线范围，通过荧光强度峰图，可以直观对比对照组与处理组不同通道的荧光强度差别.如图4所示.

图4 荧光强度对比分析图像

5.5 时间序列(Time Series)扫描

共聚焦可以对标有荧光信号的活细胞实时动态观测，记录细胞内特定成分的动态变化.共聚焦是以扫描方式成像，成像速度慢，在进行时间序列扫描时，要想能及时扑捉到快速变化的信号，可以降低分辨率，增加扫描速度，或者将面(Frame)扫描变为线(Line)扫描及点(Spot)扫描，但获取的图像质量也会降低.时间序列的扫描时间可以在软件直接设置，也可以由外置设备(如电生理仪等)进行控制.如图5所示.

图5 时间序列扫描图像

5.6 光漂白(Bleach)扫描

利用光漂白扫描方法可以完成相应的荧光光漂白恢复 (FRAP)及荧光共振能量转移(FRET)等实验.先采集一张标准图像，然后选择漂白区域(Define Region)，增大激光强度，再设定漂白次数(Iterations)，以实现荧光快速淬灭的效果.结合时间序列扫描方式，就可以完成FRAP及FRET实验.如图6所示.

图6 光漂白分析图像

综上所述，通过激光扫描共聚焦显微镜可以获得高清晰、高质量的图像，还可以扩大图像的信息量，获得更多的分析结果，这些功能使得LSCM已成为生物学研究领域中必不可少的分析仪器[14-15].激光扫描共聚焦显微镜可以进行细胞形态定位、立体结构重组、动态变化过程等研究，并能提供定量荧光测定、定性图像分析等实用研究手段，结合其他相关生物技术，在形态学、生理学、免疫学、遗传学等分子细胞生物学领域将会得到更广泛应用[16-17].

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Technique and application skills of laser scanning confocal microscopy

YUE Lei，ZHANG Yao, MA Zhuo

(School of Life Science and Technology,Harbin Institute of Technology,Harbin 150080,China)

This paper introduced the working principle, conventional sample preparation and production requirements of laser scanning confocal microscopy, as well as the method of image acquisition, including the regulation of light path and light intensity adjustment, gain value and pinhole regulation, transmission light path and DIC settings. And introduced the confocal technique in biological research field, such as multi-track fluorescence collection,Z-stack scanning and three-dimensional construction, analysis of fluorescence colocalisation and intensity, time sequence scanning and bleaching technology. This paper could efficiently provide technical reference for grasping the confocal operation skills.

laser scanning confocal microscopy; image; application

2015-04-10.

岳 磊(1979-)，女，博士，工程师，研究方向：蛋白质功能.

R446

A

1672-0946(2015)03-0263-04