牟 婵，周若鹏，赖滢滢（.广东药学院中药学院，广州 50006；.广州奇绩医药科技有限公司，广州 50663）

淫羊藿具有多种药理作用[1]。研究表明，淫羊藿提取物能增加免疫球蛋白sIgA 和白介素（IL）-17 的分泌以及免疫细胞的数量从而增强免疫力[2]；淫羊藿多糖能提高机体的体液免疫和细胞免疫功能，刺激细胞产生免疫应答[3]；淫羊藿总黄酮对免疫功能低下的小鼠有良好的免疫促进作用[4]；淫羊藿苷通过诱导Th1型抗体以及调节固有免疫应答中巨噬细胞中toll样受体9的分泌可加强机体的免疫力[5-6]。而复方淫羊藿咀嚼片是根据中医对亚健康辨证的观点，从“君、臣、佐、使”理论出发，以淫羊藿为主的具有增强免疫力功能的中药处方，方中淫羊藿作为君药在增强免疫功能中发挥关键作用。为优选复方淫羊藿咀嚼片提取工艺，为其实际生产提供理论依据，从而为临床提供质量合格的制剂，笔者以淫羊藿苷、粗多糖、干膏得率为指标，采用正交设计进行试验，现介绍如下。

1 材料

1.1 仪器

JM20002 型电子天平（余姚市纪铭称重校验设备有限公司）；AUY-220型、AUW-220D型分析天平（广州仪通兴仪器仪表有限公司）；LC-20AT 型高效液相色谱仪（日本岛津公司）；800B 型离心机（上海安亭科学仪器厂）；DZTW 型调温电热套（北京市永光明医疗仪器有限公司）；UV756CRT 型紫外-可见分光光度计（上海佑科仪器仪表有限公司）。

1.2 药材、药品及试剂

淫羊藿、茯苓、女贞子等饮片（亳州市鸿泰药业有限公司，批号均为1408001、1410001、1410002、1410003），经广州分析测试中心鉴定均符合2010 年版《中国药典》（一部）要求；淫羊藿苷对照品（中国食品药品检定研究院，批号：110737-200415，纯度：供含量测定用）；葡聚糖对照品（美国Sigma公司，批号：00269，纯度：供含量测定用）；乙腈为色谱纯；其他试剂均为分析纯；水为屈臣氏蒸馏水。

2 方法与结果

2.1 提取工艺

精密称取处中淫羊藿、茯苓、女贞子等药材共18 份（正交试验共9 组，每组2 份），每份320 g，其中淫羊藿40 g，加水提取。分别取各组提取液10 ml，加水稀释并定容至100 ml，得1～18号样品溶液，供检测。

2.2 样品溶液中淫羊藿苷的含量测定

2.2.1 色谱条件 色谱柱：InertSustain C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈-水（28∶72）；流速：1.0 ml/min；检测波长：270 nm；柱温：室温；进样量：20 μl。

2.2.2 淫羊藿空白溶液的制备 称取处方中除淫羊藿以外的其余各药材，加入10倍量水，回流提取3次，每次2 h，提取液滤过，合并滤液。取滤液10 ml，加水稀释并定容至100 ml，摇匀，0.45 μm微孔滤膜滤过即得。

2.2.3 标准曲线的建立 精密称取干燥的淫羊藿苷对照品适量，置于50 ml 量瓶中，加甲醇超声溶解，定容至刻度，制备成含淫羊藿苷0.332 5 mg/ml的对照品贮备液。分别取上述贮备液0、2、4、6、8、10 ml，置于10 ml 量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，0.45 μm微孔滤膜滤过。分别取20 μl，注入液相色谱仪中测定峰面积。以峰面积（y）对淫羊藿苷质量浓度（x）进行线性回归，得回归方程为y＝38 832 934.01x－17 303.4（r＝0.999 0）。结果表明，淫羊藿苷检测质量浓度线性范围为20.8～332.5 μg/ml；定量限为20.8 μg/ml。

2.2.4 精密度、稳定性、回收率试验 按相关方法进行试验。结果，精密度试验中RSD为0.96%（n＝6）；稳定性试验中峰面积的RSD为1.04%（n＝6），供试品溶液在48 h内基本稳定；平均回收率为99.04%，RSD为1.14%（n＝6）。

2.2.5 专属性考察 分别吸取淫羊藿苷对照品溶液、供试品溶液（正交试验6号）、淫羊藿空白溶液各20 μl，进样测定。结果，淫羊藿苷对照品溶液、供试品溶液在16 min 左右出现淫羊藿苷特征吸收峰，而淫羊藿空白溶液在此处无干扰；淫羊藿苷与相邻杂质峰的分离度大于1.5；理论板数按淫羊藿苷峰计大于1 500。以上表明方法专属性良好，详见图1。

图1 高效液相色谱图A.供试品溶液；B.对照品溶液；C.空白溶液；1.淫羊藿苷Fig 1 HPLC chromatogramsA.sample solution；B.control solution；C.blank solution；1.icariin

2.2.6 样品中淫羊藿苷含量测定及提取率计算 吸取“2.1”项下1～18 号样品溶液2 ml，过0.45 μm 滤膜，精密吸取20 μl 注入色谱仪，测定。记录淫羊藿苷峰面积，由回归方程得到样品液中淫羊藿苷的质量浓度，计算淫羊藿苷的提取率（提取液中淫羊藿苷的量/药材干品中淫羊藿苷的量×100%）。

2.3 样品溶液中粗多糖含量测定[7]

2.3.1 葡聚糖标准液的制备 精密称取葡聚糖对照品10 mg，置于100 ml 量瓶中，加水溶解并定容至刻度，混匀，即得0.1 mg/ml葡聚糖对照液。

2.3.2 标准曲线的建立 采用硫酸-苯酚法。精密吸取葡聚糖对照液0.10、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00 ml，分别置于25 ml 比色管中，准确补充水至2.0 ml，加入50 g/L 苯酚溶液1.0 ml，在振荡器上混匀，加入浓硫酸10.0 ml，于振荡器上小心混匀，置于沸水浴中煮沸2 min，冷却。以试剂为参比，用分光光度法在450～550 nm波长范围内进行扫描，结果在485 nm波长处有最大吸收。选定该波长测定吸光度，以葡聚糖质量浓度（x）为横坐标、吸光度（y）为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程为y＝0.148x－0.001（r＝0.999 0）。结果表明，葡聚糖检测质量浓度线性范围为12.8～128.0 μg/ml。

2.3.3 精密度、回收率试验 按相关方法进行试验。结果，精密度试验的RSD≤2.09%（n＝6）；平均回收率为96.04%（RSD＝2.27%，n＝6）。

2.3.4 样品溶液中粗多糖含量测定 精密吸取“2.1”项下1～18 号样品溶液各2 ml，置于10 ml 离心管中，加入无水乙醇8 ml，混匀5 min，以3 000 r/min（离心半径6.6 cm）离心5 min，弃去上清液。残渣用80%乙醇溶液适量洗涤，离心后弃上清液，反复3～4次操作。残渣用2.0 ml水溶解，混匀，加入100 g/L氢氧化钠溶液2.0 ml、铜试剂溶液2.0 ml，沸水浴中煮沸2 min，冷却后以3 000 r/min离心5 min，弃去上清液。残渣用洗涤液适量洗涤，离心，弃去上清液，反复3次操作。残渣用100 ml/L硫酸溶液2.0 ml溶解并转移至50 ml量瓶中，加水稀释至刻度，混匀。此溶液为试样测定液。精密吸取试样测定液2.0 ml置于25 ml比色管中，加入50 g/L苯酚溶液1.0 ml，在振荡器上混匀后，加入浓硫酸10.0 ml 后于振荡器上小心混匀，置于沸水浴中煮沸2 min，冷却至室温。用分光光度法在485 nm波长处测定吸光度值，计算试样中水溶性粗多糖含量，同时做试样空白试验。对照品溶液、正交试验6号样品溶液的紫外吸收光谱图见图2。

图2 紫外吸收光谱图A.对照品；B.供试品Fig 2 UV absorption spectrumA.substance control；B.test sample

2.4 浸膏得率测定[8]

精密吸取1～18号样品滤液30 ml，至已恒质量的坩埚中，水浴蒸干后，105 Ⅹ烘3 h，冷却，精密称定，计算浸膏得率（浸膏质量/药材质量×100%）。

2.5 正交试验及其结果

2.5.1 正交试验 根据单因素初筛试验结果，分别确定加水倍量（加水体积∶药材质量）（A）、提取时间（B）、提取次数（C）为因素，每个因素各取3 个水平，按L9（34）正交试验安排用水进行回流提取，提取液过滤后合并。因素与水平见表1。

表1 因素与水平Tab 1 Factors and levels

按照表L9（34）正交设计安排试验，评价指标为粗多糖含量、淫羊藿苷提取率、浸膏得率，综合评分＝（粗多糖含量/粗多糖最大含量×0.4+淫羊藿苷提取率/淫羊藿苷提取率最大值×0.35+得膏率/得膏率最大值×0.25）×100。正交试验安排与结果见表2，方差分析见表3。

表2 正交试验安排与结果Tab 2 Design and results of orthogonal test

表3 方差分析结果Tab 3 Analysis result of variance

由表2、表3可知，各因素影响程度顺序为C＞B＞A，提取次数影响最大，其次是提取时间，最后为加水倍量；正交试验显示最优工艺为A1B3C3。由方差分析可知，C因素各水平对粗多糖含量、淫羊藿苷转移率和得膏率有显著性影响（P＜0.01），选择C3为最优；B 因素各水平对指标成分含量影响有区别（P＜0.1），选择B3为最优；A因素则对试验指标的影响较小，从工业化生产角度考虑，减少提取溶剂可有效降低成本，故选择A1水平。由此确定最优工艺为A1B3C3，即：称取处方量药材，加入6倍量的水，微沸回流提取3次，每次2 h。

2.5.2 验证试验 精密称取3 批干燥的处方各药材共320 g，按最优工艺条件平行操作，测定粗多糖含量、淫羊藿苷转移率、干膏得率，结果见表4。

表4 验证试验结果Tab 4 Results of validation test

结果表明，用最优工艺条件提取，提取物中粗多糖含量、淫羊藿苷转移率均较高，且高于其他各正交试验值；综合评分均值99.69，也高于正交试验中最高值；且各指标3 次试验的RSD均≤0.55%，故所选最优工艺条件合理、稳定性较好。

3 讨论

采用多指标并经正交试验综合平衡后所得的工艺条件，能根据实际需要并兼顾到各指标的理化性质[9]。本试验以粗多糖含量、淫羊藿苷提取率、干膏得率为指标，经综合平衡后选择最优工艺，兼顾到粗多糖为本方中君臣佐药中所含的增强免疫力的主要成分，在综合评分中权重系数为0.4；淫羊藿苷为君药淫羊藿主要成分，评分时权重系数为0.35，以保证所选工艺对臣药主要成分的提取率；干膏得率权重系数为0.25，以控制所选工艺所得干膏量适当，便于控制日服用量。

在选择提取溶剂时，根据各指标成分的理化性质，分别以水和50%乙醇为提取溶剂，在同等条件下考察粗多糖含量、淫羊藿苷提取率及得膏率。在前期试验中，选用不同溶剂提取时，粗多糖含量以水提取时为16.65 mg/g，以50%乙醇提取时为4.37 mg/g；淫羊藿苷提取率以水提取时为87.21%，以50%乙醇提取时为94.33%；浸膏得率以水提取时为27.48%，以50%乙醇提取时为30.17%。根据以上对比试验，并考虑到粗多糖以水为溶剂提取较以醇为溶剂提取率更高，以及能耗、成本等方面的因素，最后确定水为提取溶剂。

在对提取液中的淫羊藿苷进行含量测定时，考察了不同流动相对峰形的影响。流动相采用乙腈-水（30∶70）时[8]，色谱峰峰形对称，但保留时间过短，分离度不好；流动相采用乙腈-水（26∶74）时[10]，色谱峰峰形对称，但保留时间过长；流动相采用乙腈-水（28∶72）时色谱峰峰形对称，分离效果佳，保留时间适中，故最终选用其为流动相组成。

本试验方法操作简便，优选出的提取工艺稳定性好、可靠性强，可为进一步开发利用该有效成分提供重要的试验基础。

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