邓秀君

实验研究

中药联合干细胞移植对缺血再灌注大鼠脑内GDNF的影响

邓秀君

目的研究应用骨髓单个核细胞(BMNC)、骨髓间充质干细胞(BMSC)蛛网膜下腔移植联合中药蝮龙抗栓丸对缺血再灌注(MCAO)脑损伤大鼠脑内胶质细胞源性神经生长因子(GDNF)的影响。方法140只Wistar雄性大鼠随机分为七组：中药联合BMSC组、BMSC组、中药联合BMNC组、BMNC组、模空组、假手术组、正常组, 每组20只, 分析其不同干预方法。治疗干预后4、28 d应用定量酶联免疫吸附法(ELISA)测定各组实验大鼠脑组织内GDNF的含量。结果中药联合BMNC组 和中药联合BMSC组较其他组在移植4 d和28 d均能上调脑组织内GDNF水平(P＜0.05), 且4 d时中药联合BMNC组上调能力更强(P＜0.05)。结论中药分别与两种细胞联合均可显著上调GDNF水平；中药联合BMNC在移植早期上调GDNF的效果更明显, 移植后期两者效果趋同。

蝮龙抗栓丸；胶质细胞源性神经生长因子；细胞移植；骨髓间充质干细胞；骨髓单个核细胞

缺血性脑卒中是神经病学中的常见病、多发病, 致残率高, 越来越受到人们的重视。骨髓源细胞通过自分泌或旁分泌神经营养因子(NTF), 促进血管增生, 保护神经组织, 减少细胞凋亡, 增加脑室周围的内源性神经干细胞及祖细胞的增殖和分化[1], 为内源性和外源性干细胞存活和分化提供有利的微环境, 使受损脑组织达到功能恢复的目的。作者应用定量ELISA方法检测缺血再灌注(middle cerebral arterial occlusion, MCAO)脑损伤大鼠脑组织中GDNF含量, 并通过比较含量的变化分析骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells, BMSC)和骨髓单个核细胞(bone marrow mononuclear cells, BMNC)移植合并中药治疗作用。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料 Wistar大鼠, SPF/VAF级, 共计150只。其中3～4个月龄, 平均体质量(280±20)g, 雄性,140只；3～4周龄,70～90 g, 雄性,10只(北京维通利华实验动物技术有限公司)。主要试剂：胎牛血清、培养基L-DMEM、0.25％胰酶(美国GIBCO公司)；大鼠淋巴细胞分离液(中国医学科学院生物工程研究所)；0.9％生理盐水(沈阳北方制药厂)。蝮龙抗栓丸(沈阳市第二中医医院, 主要成分为天麻、菖蒲、黄芪、丹参、川芎、蝮蛇等)。

1.2 实验方法

1.2.1 骨髓细胞的分离培养 Wistar大鼠,3～4周龄,10％水合氯醛腹腔麻醉, 无菌条件取出双侧股骨、胫骨。磷酸缓冲液(PBS)反复冲洗剪掉两端的骨髓腔。离心, 得到中间单层细胞。将分离得到的细胞中加入含10％胎牛血清的L-DMEM培养基,5％ CO2、37℃、饱和湿度下培养。24 h后更换培养液, 每3天更换新培养液。镜下观察细胞生长达80％～90％时, 用0.25％胰蛋白酶消化备用。

1.2.2 动物分组与干预 Wistar雄性大鼠,3～4个月龄,140只随机分为七组：中药联合BMSC组、BMSC组、中药联合BMNC组、BMNC组、模空组、假手术组、正常组, 每组20只。因手术意外等原因, 最终纳入112只, 平均每组16只。术后24 h将细胞移植到蛛网膜下腔并行中药灌胃治疗,1次/d。4、28 d取大鼠损伤侧脑组织。

1.2.3 大鼠脑损伤模型建立 按照Longa等[2]改良线栓法,建立大鼠大脑中动脉栓塞2 h再灌注模型：取雄性Wistar大鼠,3～4个月龄, 腹腔麻醉。分离暴露右侧颈总动脉(CCA),颈内动脉(ICA), 颈外动脉(ECA), 在根部结扎ECA, 结扎CCA,在CCA近颈外、颈内分叉处剪一小口, 将5 cm的末端烧成圆头尼龙线缓慢送入ICA, 深度约为(18±2)mm, 结扎ICA, 在大脑中动脉(MCA)起始端堵塞血流。2 h后, 抽出尼龙线, 恢复灌注。大鼠苏醒后进行神经损伤严重程度评分(NSS), >6分为造模成功, 其他予以剔除。正常组大鼠不做处理, 假手术组大鼠操作至暴露ICA、ECA。

1.2.4 蛛网膜下腔移植骨髓细胞 将直接分离获得的BMNCs或原代培养的BMSC单细胞悬液, 在MCAO模型大鼠造模24 h后, 从枕骨大孔处将细胞以1 μl/min进行蛛网膜下腔注射。模空组以0.01 MPBS代替。移植细胞体积为100 μl, 总数为2×107个。

1.3 实验取材与指标测定10％水合氯醛麻醉大鼠。取右侧后半球, 匀浆并稀释。美国ADL.inc.BDNF定量ELISA检测试剂盒, 参照试剂盒测试步骤进行, 浓度单位1.0 pg/ml。利用微板酶标测定仪进行数据测定, 读取波长450 nm处OD值, 并将测量值所测值按标准曲线换算。

1.4 统计学方法 采用PEMS3.1软件处理相关数据。计量资料以均数 ± 标准差(±s)表示, 采用t检验。设定检验水平α=0.05, P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

按相应标准曲线换算成GDNF含量,4、28 d时各组大鼠脑组织中GDNF含量比较, 见表1。

表1 4、28 d各组大鼠脑组织中GDNF含量比较(±s, pg/ml)

表1 4、28 d各组大鼠脑组织中GDNF含量比较(±s, pg/ml)

注：与其他各组比较,aP<0.05；干预4 d时与中药联合BMSC组比较,bP<0.05 ；同组干预4 d时与干预28 d时比较,cP<0.05

组别 N只数 4 d 28 d正常组假手术组模型组BMNC组中药联合BMNC组BMSC组中药联合BMSC组16161616161616122.26±16.90125.92±18.19139.07±19.51194.21±39.56560.61±194.84abc169.83±28.84370.93±46.19ac53.46±3.9153.00±4.5762.60±4.0567.70±4.73247.83±99.58a82.66±32.23247.34±98.02a

3 讨论

3.1 骨髓间充质干细胞的自分泌与旁分泌 脑缺血损伤可引起脑内各种神经营养因子的分泌增加[3], BMSC移植会明显提高多种NTF的分泌。BMSC分泌的营养因子, 能够对脑缺血后的功能障碍起到改善, 促进局部组织血管再生和功能恢复；BMSC可分泌白细胞介素、巨噬细胞集落刺激因子、Rt,3配体及干细胞因子等； BMSC能够合成细胞外基质, 如纤维连接蛋白、胶原蛋白和层粘连蛋白, 还可以合成集落刺激因子、骨形成蛋白及造血调节因子等；BMSC还可分泌和释放儿茶酚胺和特殊的神经递质。

BMSC也可形成旁分泌效应, 影响脑组织的内分泌功能。移植的BMSC可增加脑内生长因子的表达, 使宿主脑组织内的生长因子含量增加, 减少神经细胞的凋亡, 提供适宜的微环境促进修复神经组织和重建功能；此外, BMSC可提供某种促分化因子改善损伤脑组织, 促进神经干细胞和前体细胞的增殖、迁移、分化和成熟, 生成新的神经元和胶质细胞,促进神经功能的改善[1]。

3.2 中药联合骨髓干细胞移植对MCAO脑内GDNF的影响GDNF在促进中枢神经细胞生长、营养神经元方面作用明显, 是具有抗神经元凋亡和阻止神经细胞萎缩的唯一已知的因子。

GDNF因子在脑缺血再灌注后表达量的上调可能是因为构成炎症过程的某个组成部分参与到神经元自身保护机制中, GDNF在脑缺血急性期损伤之后的表达下调可能与停止引起基因表达微弱或能量代谢较低有关, 考虑这种表达的时程差异与动物种属及缺血模型有关。

总之, 中药分别与两种细胞联合均可显著上调GDNF水平；中药联合BMNC在移植早期上调GDNF的效果更明显,移植后期两者效果趋同。

[1]Chen CG, Li Y, Wang L, et al. Ischemic rat brain extracts induce human marrow stromal cell growth factor production. Neuropathology,2002,22(4):275-279.

[2]Longa EZ, Weinstein PR, Carlson S, et al. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats. Stroke,1989,20(1):84-91．

[3]Kirmaird T, Stabile E, Bumett MS, et al. Loeal delivery of marrowderived stromal cells augments collateral perfusion through paracrine mechanisms.Circulation,2004,109(12):1543-1549.

10.14164/j.cnki.cn11-5581/r.2015.06.199

2014-12-02]

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