刘莹莹 苏碧丽 庞文生 胡娟

实验研究

野葛、粉葛水煎液和醇提液中3种异黄酮成分含量的比较研究

刘莹莹 苏碧丽 庞文生 胡娟

目的对野葛、粉葛饮片水煎液和醇提液中3种主要成分含量进行比较研究, 探讨两种葛根主要成分的差异。方法采用高效液相色谱法测定野葛和粉葛水煎液、乙醇提取液中3’-羟基葛根素、葛根素和大豆苷元的含量。结果野葛与粉葛相比, 无论在醇提液还是水煎液中, 野葛中的3’-羟基葛根素、葛根素和大豆苷元这三个成分含量都高于粉葛。野葛水煎液中3’-羟基葛根素含量是野葛醇提液的6.63倍, 野葛水煎液中葛根素含量是野葛醇提液的3.49倍, 野葛水煎液中大豆苷元含量与野葛醇提液基本相同；但是在粉葛醇提液中这三个成分含量略高于水煎液。结论在醇提液和水煎液中,野葛的3种异黄酮成分含量均高于粉葛。

葛根为豆科葛属野葛 Pueraria lobata (Willd.) Ohwi的干燥根, 习称野葛。而葛根的另一来源豆科葛属甘葛藤P. thomsonii Behth. 的干燥根, 称为粉葛。两者均载于《中国药典》, 并广泛应用于临床。葛根味甘、辛、凉, 具有解肌退热、生津、透疹、升阳止泻之功效［1］。有文献报道葛根的主要活性成分是3’-羟基葛根素、葛根素及大豆苷元等异黄酮类化合物［2-4］, 其具有降血压、保肝、降血糖、降血脂、治疗颈椎病等疗效［5-7］。2010版药典中葛根与粉葛的质量控制指标是测定葛根素含量［8］。多指标成分含量的同时测定是当今中药质量控制的发展趋势［9-11］。葛根乙醇提取液中多种成分的同时测定已有报道［12,13］, 但野葛、粉葛水煎液中3’-羟基葛根素、葛根素及大豆苷元3种异黄酮成分的含量测定未见报道。中药煎煮是中药饮片临床用药的主要方式, 水煎液中有效成分的含量对中药饮片发挥药效起着至关重要的作用。本文采用高效液相色谱法同时测定葛根醇提液和水煎液中3’-羟基葛根素、葛根素、大豆苷元的含量, 对比野葛、粉葛三种异黄酮成分的差异, 评价其质量, 为葛根的临床用药提供理论依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器 Waters2695高效液相色谱系统,2998型二极管阵列检测器, Empower3数据处理系统(美国 Waters 公司), KQ250E 型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司), Milli-Q 超纯水设备(美国 Millipore 公司), 滤膜(美国Millipore 公司, 孔径0.45 μm)。

1.2 试剂与药材 葛根素对照品(中国药品生物制品检定所, 批号：110752-201313)；3’-羟基葛根素对照品(成都普菲德生物技术有限公司, 批号：130416)；大豆苷元对照品(中国药品生物制品检定所, 批号：111502-200402)；野葛购自福建祥安药业有限公司(上海康桥中药饮品有限公司, 产地：四川, 批号：120509、120513、120520)；粉葛购自福建中医药大学国医堂(安徽源和堂药业股份有限公司, 产地：广西,批号：1202201、1202205、1202209)；乙醇(国药集团化学试剂有限公司, 分析纯), 甲醇、乙腈(德国 Merck 公司, 色谱纯)。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 色谱柱：Hypersil C18色谱柱(4.6 mm×250 mm,5 μm)；检测波长：250 nm；柱温：30℃；对照品、醇提液、水煎液进样体积分别为：10、20、6 μl；流速：1.0 ml/min；梯度洗脱程序见表1。在此色谱条件下各对照品和供试品色谱图见图1, 色谱图中3个成分分离良好。

表1 梯度洗脱程序

图1 高效液相色谱图

2.2 溶液的制备 样品的测定方法参照《中国药典》2010年版(一部)附录Ⅵ D 高效液相色谱法外标法测定, 具体操作方法如下。

2.2.1 对照品溶液的制备 精密称取3’-羟基葛根素、葛根素和大豆苷元对照品1.66、1.65、2.06 mg, 分别用甲醇溶解,定容至5 ml, 得3’-羟基葛根素、葛根素和大豆苷元对照品储备液, 精密量取上述各溶液3 ml 置于容量瓶中, 摇匀, 作为3’-羟基葛根素、葛根素和大豆苷元对照品溶液, 对照品浓度分别为0.11、0.11、0.14 mg/ml。

2.2.2 野葛和粉葛醇提液供试液的制备 取葛根(0.5 g)、粉葛(0.5 g)饮片粉末, 精密称定, 分别置于具塞锥形瓶中, 精密加入30％乙醇50 ml, 超声30 min, 放冷, 定容至50 ml, 然后摇匀, 滤过。取续滤液, 即得野葛和粉葛醇提液供试液,其生药量分别为10.00、10.00 mg/ml。

2.2.3 野葛和粉葛水煎液供试液的制备 分别精密称取野葛饮片和粉葛饮片50 g, 浸泡15 min, 分别加水煎煮2次(每次加水量为500 ml；每次煎煮时间为30 min), 趁热用四层纱布滤过。合并滤液, 分别得到860、870 ml滤液, 即得野葛和粉葛水煎液供试品溶液, 其生药量分别为58.14、57.47 mg/ml。

2.3 线性范围考察 分别精密吸取上述混合对照品溶液0.01、0.1、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 ml, 置于10 ml容量瓶内,以甲醇定容至刻度, 经 0.45 μm 微孔滤膜过滤, 得3’-羟基葛根素、葛根素和大豆苷元系列混合对照品溶液。按“2.1”项下方法测定。结果表明：3’-羟基葛根素、葛根素和大豆苷元的浓度在 0.11～27.50、0.11～27.50、0.14～0.35 μg/ml的范围内与峰面积呈良好的线性关系。

2.4 精密度试验 取同一混合对照品混合溶液(3’-羟基葛根素、葛根素和大豆苷元的浓度分别为0.11、0.11、0.14 mg/ml),于同一天内连续进样测定6次, 测得3’-羟基葛根素、葛根素和大豆苷元峰面积的相对标准偏差(RSD)为0.67％、0.56％、0.83％, 日内精密度良好, 表明仪器较为稳定。

2.5 重复性试验 取同一批葛根饮片, 按“2.2”项下方法制备供试液溶液, 各平行6份。

按“2.1”项下色谱条件进样测定, 分别记录各色谱峰面积。计算得野葛醇提液和水煎液中3’-羟基葛根素、葛根素和大豆苷元的平均含量(n=6)分别为0.77％、2.87％、0.10％和0.23％、0.86％、0.86％, RSD依次为1.02％、1.32％、1.28％和1.09％、1.22％、1.27％；粉葛饮片和水煎液中葛根素和大豆苷元的平均含量(n=6)分别为0.653％、0.098％和0.077％、0.008％, RSD分别为1.34％、1.01％和0.64％、1.08％。结果表明该方法重复性良好。

2.6 稳定性试验 取野葛、粉葛醇提液供试品溶液和野葛、粉葛水煎液供试品溶液, 分别于1、2、3、4、8、12、24 h按“2.1”项下方法测定, 记录峰面积。结果显示, 野葛醇提液供试液日内稳定性的RSD=0.48％ (n=6), 粉葛醇提液供试液日内稳定性的RSD=0.29％ (n=6), 野葛水煎液供试液日内稳定性的RSD=0.67％ (n=6), 粉葛水煎液供试液日内稳定性的RSD=0.69％ (n=6), 表明表明野葛、粉葛醇提液供试液和野葛、粉葛水煎液供试液的稳定性良好。

2.7 定量限和检测限 将各对照品溶液梯度稀释至一定浓度, 以信噪比3：1为检测限(LOQ), 以信噪比10：1为定量限进行测定(LOD), 测得3’-羟基葛根素的定量限为45.3 ng/ml,检测限为15.4 ng/ml；葛根素的定量限为73.5 ng/ml, 检测限为21.4 ng/ml；大豆苷元的定量限为55.1 ng/ml, 检测限为18.2 ng/ml。

2.8 计算方法 供试品的百分含量计算公式为：

公式中, AX为供试品的峰面积；AR为对照品的峰面积；mR为对照品的进样质量；MX为供试品的进样生药量。

2.9 样品测定 精密称取3个批次的样品, 分别按“2.2”项下方法制备野葛和粉葛醇提液供试液及水煎液供试品溶液, 各平行3次。按“2.1”项下色谱条件进样测定, 计算野葛、粉葛醇提液和水煎液中3’-羟基葛根素、葛根素和大豆苷元含量。测定结果见表2, 色谱图见图1。

表2 野葛、粉葛醇提液和水煎液中3’-羟基葛根素、葛根素和大豆苷元的含量(n=3, ％)

3 讨论

野葛和粉葛中虽主要含有3’-羟基葛根素、葛根素和大豆苷元等异黄酮成分, 但两个品种中各种异黄酮的含量具有一定差别, 本实验结果显示, 无论在醇提液还是水煎液中,野葛中的3’-羟基葛根素、葛根素和大豆苷元这三个成分含量都高于粉葛。野葛水煎液中3’-羟基葛根素含量是野葛醇提液的6.63倍, 野葛水煎液中葛根素含量是野葛醇提液的3.49倍, 野葛水煎液中大豆苷元含量与野葛醇提液相同；但是在粉葛醇提液中这三个成分含量略高于水煎液。粉葛中化学成分不仅在种类和含量上不如野葛, 而且其化学成分还较难融入到汤剂中, 这可能与粉葛富含淀粉, 水煮时, 淀粉粒易糊化, 在饮片表面形成保护膜, 有效成分不易煎出有关,故临床使用葛根优先选用野葛；但因粉葛栽培产量高, 并且富含淀粉, 适用于养生保健原料。

［1］陈文杰. 葛根药理作用及临床应用研究进展.中国现代医药杂志,2008,10(12):142-144.

［2］王爱梅, 田敏. 葛根异黄酮对衰老模型大鼠学习记忆功能及海马酶学的影响. 重庆医学,2011,40(22):2251-2253.

［3］高靖, 陈继红. 葛根及葛根异黄酮的研究现状.畜牧与饲料科学,2013,34(6):44-45.

［4］罗兰, 高淑娟, 王淑美, 等. 脑脉通有效部位中葛根异黄酮类成分的含量测定. 中成药,2010,32(4):604-606.

［5］刘海英. 葛根素对大鼠血脂和血粘度的影响. 中国民族民间医药杂志,2013,22(18):12.

［6］钟保恒. 葛根素药理研究现状. 中国民族民间医药杂志,2009,18(5):16-18.

［7］杨彩媚, 庞文生, 张宽, 等. 葛根及其复方对椎基底动脉型颈椎病的作用.中国民族民间医药杂志,2013，22(4):103.

［8］国家药典委员会. 中华人民共和国药典2010年版(一部). 北京：中国医药科技出版社,2010:272,312.

［9］杨义芳, 萧伟. 基于多成分多靶点的中药药动/药效相关性研究解读与策略. 中草药,2013,44(12):1521-1528.

［10］刘荣霞, 叶敏, 果德安. 中药质量控制研究的思路与方法. 中国天然药物,2006(5):332-337.

［11］戚进, 余伯阳. 中药质量评价新模式——“谱效整合指纹谱”研究进展. 中国天然药物,2010(3):171-176.

［12］凌樱珊, 胡向全, 李文楷, 等. HPLC测定葛根中葛根素和大豆苷的含量. 中国民族民间医药杂志,2012,21(9):31-33.

［13］杨雪芳, 黄伟, 丁建清. RP-HPLC法测定美国不同产地野葛根和叶片中葛根素、大豆苷和大豆苷元含量的研究. 植物科学学报,2013,31(4):391-397.

Comparative study of three kinds of isoflavonoid in ethanol extracts and decoction of pueraria lobata and pueraria thomsonii

LIU Ying-ying, SU Bi-li, PANG Wen-sheng, et al. Fujian University of Traditional Chinese Medicine, Fuzhou350122, China

ObjectiveTo compare contents of three kinds of main elements in ethanol extracts and decoction of pueraria lobata and pueraria thomsonii, and to investigate the main difference between the two kinds of pueraria lobata.MethodsThe contents of3’-hydroxy puerarin, puerarin, and daidzein in ethanol extracts and decoction of pueraria lobata and pueraria thomsonii were detected by high performance liquid chromatography.ResultsPueraria lobata had higher contents of3’-hydroxy puerarin, puerarin, and daidzein in both ethanol extracts and decoction than pueraria thomsonii. The content of3’-hydroxy puerarin in decoction of pueraria lobata was6.63 times of that in ethanol extracts, and the content of puerarin in decoction of pueraria lobata was3.49 times of that in ethanol extracts. The content of daidzein in decoction of pueraria lobata was basically the same as that in ethanol extracts. The ethanol extracts of pueraria thomsonii had larger contents of the three elements than the decoction.ConclusionThe contents of three kinds of isoflavonoid in the decoction and ethanol extracts of pueraria lobata are higher than those of pueraria thomsonii.

Pueraria lobata; Pueraria thomsonii; Puerarin;3’-hydroxy puerarin; Daidzein

10.14164/j.cnki.cn11-5581/r.2015.05.194

2014-11-26］

国家自然科学基金项目(项目编号：81274050)

350122 福建中医药大学

胡娟

【关键词】野葛；粉葛；葛根素；3’-羟基葛根素；大豆苷元