龙新华，刘志礼，刘家明，陈宣银，王 恒，周 扬，张志宏

（南昌大学第一附属医院骨科，南昌330006）

近年来众多研究表明，脂肪酸合成酶（FASN）在多种恶性肿瘤中高表达与肿瘤转移密切相关［1-3］，大量前期研究也证实FASN高表达在骨肉瘤转移中扮演重要的角色［4-6］。但是FASN在骨肉瘤中高表达的调控机制仍不清楚。近年来，大量研究证实microRNA不但参与肿瘤的发生、增殖、凋亡，而且对肿瘤转移具有调节作用［7-9］。本研究拟通过生物信息学预测，寻找可能调控FASN基因表达的mi RNA分子，并用RT-PCR法检测这些分子在不同侵袭能力骨肉瘤细胞中的表达，从而筛选出可能靶向调控FASN基因影响骨肉瘤侵袭转移的miRNA分子，为进一步研究骨肉瘤中FASN基因高表达的分子机制提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 材料U2-OS、HOS细胞株购自上海中科院细胞库；SYBR Premix Ex Taq TMⅡ定量PCR试剂盒购自TaKaRa 公司；实时定量PCR（RT-PCR）引物（含内参U6 引物）由华安平康公司设计并合成；Rever Tra Ace-α-TM逆转录试剂盒购自TOYOBO公司；兔抗人FASNIg G，鼠抗人GAPDHIgG购自英国Abcam公司；Mat r ige l 基质胶购自美国BD公司。

1.2 方法

1.2.1 生物信息学预测 应用micro RNA在线数据库Targetscanhuman6.2 （http：／／www.targetscan.org／）和microrna.org（http：／／www.microrna.org／microrna／search Mirnas.do），针对FASN基因（NM＿004104）预测可能调控其表达的miRNA分子。选取2种预测结果的交集m i RNA分子进行RT-PCR 定量检测。

1.2.2 RT-PCR 检测miRNA分子在骨肉瘤细胞HOS、U2-OS 中的表达 用Tr izol 法处理骨肉瘤细胞，提取总RNA，紫外分光光度仪检测所提取的总RNA浓度和质量。然后取1 μg 总RNA，用Rever Tra Ace-α-TM逆转录试剂盒（TOYOBO公司）逆转录为cDNA，并以此为模板进行RT-PCR 扩增反应。RT-PCR 引物（含内参U6 引物）由华安平康公司设计并合成，序 列 如 下：hsa-miR-15a-5p正向引物 5′-CCAGCTGGGCTTTTTGCGGTCTGG-3′；hsa-miR-15b-5p 正向引物5′-CCAGCTGGGTAGCAGCACAGAAAT-3′；hsa-miR-16-5p正向 引 物5′-CCAGCTGGGCAGCAGCAATTCATGT-3′；hsamiR-195-5p正向引物5′-CCAGCTGGGCAGCAGCACACTGTG-3′；hsa-miR-495-3p正向引物5′-CCAGCTGGGACTCCATTTGTTTTGAT-3′；U6（内参）正向引物5′-CCAGCTGGGATCACATTGCCAGGG-3′；通用反向引物（SLR-primer）5′-CTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATT-3′。按照SYBR Premix Ex Taq TMⅡRT-PCR试剂盒（TaKaRa 公司）说明书进行操作。反应条件：94 ℃变性5 min，一个循环，94℃变性30 s，55℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共40 个循环。反应结束后确认RT-PCR 的扩增曲线和熔解曲线，进行数据分析。不同时间重复6 次实验。

1.2.3 Western blot 检测U2-OS 和HOS 细胞中FASN的表达水平 收集对数期生长的骨肉瘤细胞，RIPA裂解，提取总蛋白，BCA法蛋白定量，10%十二烷基-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）凝胶电泳分离蛋白，转膜，5%脱脂奶粉封闭1 h，一抗（兔抗人FASN IgG，1∶1000，鼠抗人GAPDH IgG，1∶2500）室温孵育2 h，TBST洗膜3 次，二抗（山羊抗兔和山羊抗鼠，1∶5000）室温孵育1 h，TBST洗膜3 次，Pro-light HRP 化学发光检测试剂（TIANGEN，PA112）化学发光，压片，拍照，用Image J 软件对条带灰度值进行分析。不同时间重复实验6 次。

1.2.4 Transwell 侵袭实验检测细胞侵袭能力 将HOS、U2-OS 细胞用含10g／L 的牛血清清蛋白（BSA）无血清培养基重悬，调整细胞浓度为1 ×105 个／mL，取150μL 细胞悬液接种小室，然后将小室放入加有600μL／孔含10%胎牛血清的HAM′S／F-12 培养基的24 孔板中，常规培养24 h。取出小室，吸弃上室液体，用PBS 漂洗2 次，95%乙醇固定10 min，用棉签擦净小室膜上侧未迁移的细胞，4 g／L结晶紫染色20 min，PBS漂洗2 次。倒置显微镜下随机选取10 个视野观察细胞穿膜情况并拍照，Image J 分析软件计数。不同时间重复实验6 次。

1.3 统计学处理 采用SPSS19.0 进行统计学分析，计量资料以±s表示，采用独立样本t 检验比较2 个细胞侵袭能力及各miRNA在2 个细胞中的表达差异，用Pearson 法进行相关性分析，以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 生物信息学预测结果 生物信息学预测软件TargetScan.human6.0 和microrna.org预测结果的交集显示有6个可能靶向调控FASN基因的m i RNA分子，分别为：miR-195／15a／15b／16／424／497，见图1。

2.2 骨肉瘤细胞U2-OS 和HOS 中各miRNA表达量比较RT-PCR 实验结果显示，在预测出的6 个mi RNAs 中，miR-424在HOS 细胞中表达水平显著高于在U 2-OS 细胞中的表达水平，HOS／U2-OS 为（543.4429±39.7931）倍；而miR-195／497／15a／15b／16 在HOS 细胞中的表达水平略高或略低于U2-OS 中的表达水平［HOS／U2-OS 分别为（1.5885±0.1533）、（1.4051±0.0545）、（0.6667±0.0692）、（0.6532±0.3005）及（0.5277±0.0268）倍］，均小于2 倍，见表2。

2.3 骨肉瘤细胞U2-OS 和HOS 中FASN表达水平比较Western blot 实验结果显示（图2），U2-OS 细胞中FASN表达水平高于HOS细胞中表达水平，差异具有统计学意义（P＜0.05）。

图1 生物信息学预测结果

表2 骨肉瘤细胞U2-OS、HOS 中各miRNAs 表达量比较

图2 Western blot 实验结果

2.4 骨肉瘤细胞U2-OS和HOS侵袭能力的比较Transwell 实验结果显示，24 h内骨肉瘤细胞U 2-OS穿膜数（62.4±4.4）个／视野，明显高于HOS 细胞穿膜数（27.4±4.7）个／视野（P＜0.05），见图3。结果提示U2-OS 细胞侵袭能力显著高于HOS 细胞。

图3 Transwell invasion 实验结果（结晶紫染色×200）

3 讨 论

骨肉瘤好发于儿童及青少年，恶性度高，肺部转移早，有约80%的患者往往在确诊时已经存在肺部微转移［10］，这是骨肉瘤患者总体生存率徘徊不前的主要原因，也是骨肉瘤防治的关键所在。因此，寻找新的分子靶点、深入研究骨肉瘤侵袭转移发生、发展的分子机制，对提高骨肉瘤治疗具有非常重要的意义。

FASN是细胞质内的一种大分子多功能酶，在合成内源性脂肪酸的过程中起关键作用。FASN与肿瘤的关系十分密切。Silva 等［1］在头颈部鳞状细胞癌研究中发现FASN高表达与头颈部鳞状细胞癌肺转移呈正相关，并且FASN高表达是头颈部鳞状细胞癌肺转移的一个重要特征。Carvalho 等［2］利用小鼠黑色素瘤模型发现抑制FASN能减少黑色素瘤细胞转移扩散；Murata 等［3］在直肠癌的研究中也发现抑制FASN的表达能抑制直肠癌的肝转移。本研究前期对新鲜骨肉瘤组织进行实验分析结果显示，FASN在骨肉瘤中呈高表达，且发生转移的骨肉瘤组织中的表达量明显高于未发生远处转移骨肉瘤组织［11］。本研究在骨肉瘤细胞实验中也证实，抑制FASN骨肉瘤细胞中表达能显著降低骨肉瘤细胞的迁移、侵袭能力，下调PI3K／Akt／NF-κB 通 路 为 其 重 要 调 控 通 路 之 一［5-6］。然 而FASN在骨肉瘤中高表达的调控机制如何，目前仍不清楚。

近年来，miRNA的发现为研究肿瘤转移调控机制提供了新的视角。miRNA是一类长度在22 个核苷酸（nt）的参与基因转录后水平调控的内源性非编码小分子RNA，通常与靶基因mRNA的3′-UTR部分序列反向互补结合而抑制翻译过程，具有调节细胞分化、增殖、凋亡、发育和代谢等生命活动的功能。有研究报道，miRNA-7、miRNA-10 参与神经胶质瘤、乳腺癌转移调控［12-13］；也有研究者证实，miRNA-21、miRNA-221等miRNAs 在骨肉瘤发生、发展及转移过程中发挥重要作用［14-15］。因此寻找miRNA与靶基因之间的调控关系在骨肉瘤转移机制研究中可行而有意义。

本研究首先运用2 种不同生物信息学预测的方法，预测出可能调控靶基因FASN的miRNAs，然后检测这些miRNAs 在不同侵袭能力的骨肉瘤细胞U2-OS 和HOS中的表达水平。本研究 结 果 显 示，miR-195／15a／15b／16／424／497同 时 被2种生物信息学预测方法预测出可能靶向调控FASN基因表达；用RT-PCR对这些mi RNA在骨肉瘤细胞U2-OS、HOS 中表达进行定量检测发现：miR-424在HOS细胞中表达相对于U2-OS 细胞中高出（543.4429±39.7931）倍，而在其余micro RNA在HOS 中表达高出或低于U2-OS 中表达都在2 倍之内；U2-OS细胞中F A SN蛋白表达水平明显高于HOS中FASN表达水平；同时Tanswell invasion 实验证实骨肉瘤U2-OS 细胞侵袭能力明显高于HOS 细胞。

综上所述，miR-424 在骨肉瘤细胞中表达水平与细胞侵袭能力呈负相关，因而miR-424 很可能通过靶向调控FASN基因在骨肉瘤侵袭转移中发挥重要作用，为骨肉瘤转移机制研究提供了新的思路。但是，由于体外模拟环境和体内微环境之间存在差异，miR-424 是否确实通过靶向调控FASN参与骨肉瘤转移，还需进一步大量体内外实验加以证实。

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