杨照环，何笑冬，王 颖，李 倩，舒小镭

（1.唐山市工人医院肿瘤放化疗科，河北唐山063000；2.重庆市肿瘤医院乳腺科400016；3.重庆市肿瘤医院放射治疗科400016；4.重庆市肿瘤医院核医学科400016）

乳腺癌是目前危害妇女健康的主要恶性肿瘤，每年约有近120 万妇女患上此病，且有约50 万人死于乳腺癌，具有很高的致死率［1］。相对于北美、北欧等乳腺癌高发病区，虽然我国处于低发病区，但是该病的发病率却呈现出逐年上升的趋势，越来越多地影响着人类的健康［2-3］。

乳腺癌的治疗主要有手术、内分泌治疗、化疗、放疗等手段，其中放疗在肿瘤的综合治疗中具有重要的作用［4-5］。随着设备及技术的不断进步，在很大程度上提高了肿瘤的局部控制率。但由于多数癌细胞本身具有的原发性辐射抵抗能力或者通过放射治疗后获得的继发性辐射抵抗能力，成为了影响放射治疗疗效或者癌症复发的重要原因，上述两种情况一旦发生，即使给予更高剂量的辐射剂量，也很难完全消灭癌症细胞［6-8］。

酪氨酸蛋白激酶抑制剂（tyrosine kinase inhibitor，TKI）主要以表皮生长因子受体为靶点，通过促进细胞凋亡、降低细胞辐射抗性、抑制血管形成和减少癌症细胞再增殖等机制抑制肿瘤细胞增殖［9］。本研究中通过研究TKI 联合X射线放疗对乳腺癌细胞的增殖抑制作用以及荷瘤裸鼠的肿瘤生长，以期为TKI 联合X射线放疗应用于临床提供实验基础。

1 材料与方法

1.1 材料 乳腺癌细胞系MCF-7 为唐山市工人医院肿瘤放化疗科保存；细胞培养用DMEM／F12培养基、胎牛血清为Gibco 公司产品；舒尼替尼酪氨酸蛋白激酶抑制剂（TKI 的一种）为美国FDA产品（批号：PY595201，美国Pfizer 制药公司）；X射线治疗仪为日立公司产品；细胞培养箱和酶标仪均为Thermo 公司产品；其余研究中用到的仪器及材料均为本单位自有。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 从液氮罐中取出MCF-7 细胞并解冻复苏，放入含有13%胎牛血清的DMEM／F12培养基中，置于5%CO2浓度、饱和湿度的37 ℃培养箱中培养24 h 至细胞铺满皿底85%以上。将乳腺癌细胞分为生理盐水组，TKI 干预组（TKI 处理后无X射线照射），X射线干预组（X射 线照射无TKI 处理）和TKI 联合放疗干预组。

1.2.2 噻唑蓝（MTT）实验 将培养的细胞置于无血清的培养基DMEM／F12中，同时加不同浓度（0、50、100、150、200、250、300 nmol／L）的TKI 继续培养12h 后，将细胞放到X射线治疗仪中照射，然后将细胞移入不含TKI 的培养基中培养24 h，每孔加入MTT液至终浓度为5 mg／μL，继续培养5 h，弃去培养液，每孔加入300μL 二甲基亚砜（DMSO），用酶标仪检测各孔的OD值。每孔设置3 个复孔。

1.2.3 克隆形成实验检测细胞存活率 将乳腺癌细胞消化后，经过细胞计数、稀释，接种到细胞培养皿中分别采用生理盐水、TKI、X射线和TKI 联合X射线干预，然后将细胞移入不含TKI 的培养基中培养4d，用PBS 漂洗细胞，经1%结晶紫染色，显微镜下计数，记录大于或等于50 个克隆数的细胞，计算克隆形成率：克隆形成率＝克隆数／接种细胞数×100%，克隆形成抑制率＝（生理盐水组细胞克隆数-实验组细胞克隆数）／对照组克隆数×100%，实验重复3 次。

1.2.4 建立裸鼠移植瘤模型检测联合治疗对肿瘤生长抑制作用 将MCF7细胞消化后离心，将细胞沉淀重悬于新鲜的DMEM培养基中，然后将2 ×106 MCF-7 细胞（100μL）皮下注射接种到雌性裸鼠的背部，待肿瘤直径达到约10 mm左右时用于后续实验。取建模成功的荷瘤小鼠40 只，分成4 组，分别为生理盐水组，TKI 干预组，X射线干预组和TKI 联合放疗干预组，当肿瘤体积生长到100～200 mm3时开始给予舒尼替。给药时采取灌胃给药的方式，每只小鼠每次给药0.25 mg，每2天给药1 次并测量肿瘤大小。

1.3 统计学处理 采用SPSS10.0 软件进行统计学分析，计量资料采用±s表示，采用t 检验，计数资料以率表示，采用χ2检验，以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 TKI 处理对乳腺癌细胞增殖的影响 利用不同浓度（0、50、100、150、200、250、300 nmol／L）的TKI 培养乳腺癌细胞12 h，在倒置显微镜下观察细胞生长状况，结果显示，任何浓度TKI 处理的细胞均出现不同程度的凋亡，不加入TKI 培养的细胞生长状态良好，癌细胞凋亡率随TKI 浓度的增加呈现浓度依赖性。

2.2 MTT实验M T T实验结果显示TKI 对乳腺癌细胞的IC50 和IC20 分别为113 nmol／L和34 nmol／L，因此，后续克隆形成实验及药瘤祼鼠实验采用TKI 浓度为100 nmol／L；细胞增殖抑制率随着药物浓度的增加逐渐提高，TKI 浓度为50、100、150、200、250、300 nmol／L对应的增殖抑制率分别为（11.2±1.8）%、（20.3±2.1）%、（25.7±3.2）%、（46.9±3.5）%、（69.7±5.3）%、（88.6±5.8）%；X射线照射（2 Gy）增值抑制率为（45.6±5.8）%。单独利用X射线照射也可以有效抑制乳腺癌细胞的增殖。不同浓度TKI 处理可以增加乳腺癌细胞的敏感性，且呈剂量依赖性，见表1。

表1 TKI 联合X射线对乳腺癌细胞的影响

2.3 克隆形成实验检测细胞存活率 克隆形成实验显示，经过TKI 处理或X射线处理细胞后，细胞存活率都降低，细胞存活率均低于生理盐水组（P＜0.01）。TKI 联合放疗干预组（TKI 100 nmol／L）细胞存活率最低，明显低于其他干预组，差异有统计学意义（P＜0.01），见表2。

表2 各组细胞克隆形成的抑制情况

2.4 各组荷瘤裸鼠肿瘤的生长情况 对乳腺癌移植瘤的治疗实验结果显示，TKI 联合放疗干预组对肿瘤的生长具有最强的抑制效果，见图1。

图1 各给药组对荷瘤裸鼠肿瘤生长的抑制效果

3 讨 论

乳腺癌作为女性最常见的恶性肿瘤，严重危害着广大女性的身心健康，随着医学治疗技术的进步及对癌症发生研究的深入，人们对乳腺癌生物学特性的认识观念逐渐发生变化［10］。乳腺癌的治疗也从最初单一的手术治疗，发展到如今多种治疗方式相结合的综合治疗，大大提高了乳腺癌治疗的成功率，明显提高了乳腺癌患者的成活率［11-12］。其中放射治疗结合药物治疗方式逐渐成为乳腺癌治疗手段的研究热点［13］。

EGFR是含有1186个氨基酸的糖蛋白，相对分子质量为170 ×103，具有酪氨酸激酶活性，是一种跨膜分布的细胞表面传感器。EGFR高表达具有抑制凋亡的作用和促进肿瘤内血管增生，因此它能够促进肿瘤发生、转移和侵袭［14］。EGFR表达异常主要表现为EGFR过表达和（或）突变。研究发现，EGFR在多种肿瘤中有不同程度的表达，头颈部鳞癌中表达率为90%～100%，肺癌中表达率为40%～80%，肾癌中表达率为50%～90%，结直肠癌中表达率为25%～77%，卵巢癌中表达率为25%～70%，前列腺癌中表达率为39%～47%，神经胶质瘤中表达率为40%～63%，乳腺癌中表达率为14%～90%。EGFR的过表达和（或）突变与肿瘤细胞增殖、新生血管形成、侵袭、转移、抗凋亡及对放疗耐受等密切相关［15］。在许多肿瘤发生的过程中，EGFR家族中的ERBB-2 在肿瘤细胞中的表达量明显增加，呈现过表达状态，而ERBB-2 的过表达可以降低肿瘤细胞对放射线的敏感性，增强肿瘤细胞的耐受性，进而降低放射治疗的成功率［16］。因此，选择以ERBB-2 为靶点的药物降低肿瘤细胞对辐射的耐受性，并结合放射治疗在理论上是一种行之有效的方法。本研究中选择的TKI 证实利用其以EGFR 为靶点，通过促进细胞凋亡、降低细胞抗性辐射、抑制血管形成和减少癌症细胞再增殖的特性，将TKI 处理与X射线放疗相结合［17-18］，验证联合处理对乳腺癌细胞的抑制作用。

研究结果显示，只用不同浓度的TKI 处理乳腺癌细胞，也能在一定程度上抑制乳腺癌细胞的生长，降低细胞的存活率，抑制效率与TKI 的处理浓度呈正相关。单独用2Gy 剂量X射线照射没有经过TKI 处理的细胞，也能很好的抑制乳腺癌细胞的生长，降低其存活率。但是，将TKI 处理后的细胞，再利用2 Gy 剂量X射线照射发现，乳腺癌细胞增殖抑制率明显增加，且差异有统计学意义（P＜0.05）。本研究采用肿瘤细胞克隆成形实验研究TKI 联合X射线对肿瘤细胞的存活率的影响，结果显示，TKI 联合X射线能够有效抑制肿瘤细胞的增殖。荷瘤裸鼠的实验结果证实，TKI 联合X射线能够有效抑制荷瘤裸鼠肿瘤的生长。

本研究初步得出TKI 处理乳腺癌细胞可能有辐射增敏作用，这可能是由于TKI 可以很好地与ERBB-2 的位点相结合，进而阻断了乳腺癌细胞的进一步增殖引起的，具体作用机制还需要进一步的实验证明。本研究为TKI 在乳腺癌放疗增敏作用中的应用奠定了基础，为临床中利用药物和放疗相结合的治疗方式提供新的理论依据。

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