田瑞敏，王含彦，易 芳，王晓明，陈建业△

（1.川北医学院药学院药理学教研室，四川南充637000；2.川北医学院基础医学院生物化学教研室，四川南充637000；3.川北医学院附属医院神经内科，四川南充637000）

人脑髓鞘碱性蛋白（human myelin basic protein，MBP）是由中枢神经系统少突胶质细胞和外周神经系统雪旺氏细胞合成分泌的一种强碱性蛋白质，MBP基因含有7 个外显子，其转录产物经不同方式剪接可以产生分子量大小、结构和功能不同的MBP 蛋白。在人脑主要含有21.5、20.0、18.5、17.3 和14.0 k Da MBP 等 几种 表 达 产 物［1］，人 胎 脑 中 以21.5 k Da MBP表达为主，成年脑中以18.5 k Da MBP表达最多。MBP不仅在神经纤维的绝缘和快速传导中发挥着重要作用，而且在人脑发育、神经细胞分化、髓鞘发生与髓鞘形成过程中具有重要功能。近年研究发现，21.5 kDa MBP 可能在细胞增殖与凋亡中发挥着重要调节作用。越来越多的实验研究显示21.5 kDa MBP可以促进细胞增殖、抑制细胞凋亡［2-5］。但也有部分研究得出的结论与此相反［6-7］。为进一步深入研究21.5 k Da MBP 对细胞增殖与凋亡的确切作用，作者构建了针对21.5 k DaMBP基因的序列特异性shRNA质粒载体，拟经脂质体介导的方法转染21.5 kDa MBP高表达人神经胶质瘤U 251细胞株，观察21.5 k DaMBP基因沉默对U 251细胞增殖及凋亡的确切影响。

1 材料与方法

1.1 材料 人神经胶质瘤细胞株U251 由四川大学生物化学与分子生物实验室惠赠；质粒pGenesil-1-MBP-3 和pGenesil-1-MBP-neg 由本实验室构建并验证［8］；Lipo2000 脂质体购自美国invitrogen 公司；新生牛血清与DMEM购自美国Hyclone公司；RIPA细胞裂解液购自北京普利莱基因公司；兔抗MBP单克隆抗体购自美国EPITOMICS 公司，其二抗购自武汉博士德公司；兔抗GAPDH单克隆抗体及其二抗购自武汉博士德公司；Ec L 化学发光试剂盒购自MILLIPORE公司；CCK-8 试剂盒购自碧云天生物技术研究所；Annexin V-PE细胞凋亡检测试剂盒购自南京凯基生物公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养U251细胞用新鲜完全DM EM培养液在37 ℃、5%CO2孵箱中培养，3～5 d 换1 次液，细胞长满90%培养瓶底进行传代。

1.2.2 实验分组与细胞转染 （1）实验分为3 组：基因沉默组（21.5 k DaMBP基因沉默质粒p Genesil-1-MBP-3 转染）；阴性对照组（空质粒p Genesil-1-MBP-neg 转染）；脂质体转染组（脂质体空转染）。（2）细胞转染：将U251 细胞按2 ×105～3 ×105个／孔的密度接种于6 孔板培养过夜，待细胞铺满90%以上孔底时进行细胞转染并在荧光显微镜下观察细胞转染效率。

1.2.3 实时定量PCR（RT-PCR）检测21.5 k DaMBP基因的表达 细胞转染后48 h，提取各组细胞总RNA进行逆转录，RT-PCR 检测各组细胞中21.5 k Da MBP mRNA表达水平。PCR引物序列如下：MBP上游：5′-CAA GAT GAA AAC CCC GTA GTC C-3′，下 游：5′-GTA GCC AAA TCC TGG TCT CTG G-3′，序 列 长 度132 bp；GAPDH上 游：5′-CTT TGG TAT CGT GGA AGG ACT C-3′，下 游：5′-GTA GAG GCA GGG ATG ATG TTC T-3′，序列长度141 bp。PCR反应条件：95 ℃×30 s，进行预变性；95 ℃×5 s→95 ℃×30 s，共40个循环，进行定量PCR反应；95 ℃15 s→600 C ×1 min→95℃×15 s，进行反应延伸。反应结束后，观察融解曲线。

1.2.4 Western blot 法检测21.5kDa MBP 蛋白的表达 转染后48 h，按文献［7］方法进行21.5 kDa MBP蛋白的Westernblot 检测。提取各组细胞蛋白质并测定浓度，将稀释过的蛋白质与2 ×蛋白上样缓冲液按照1∶1 的比例混匀，在沸水浴中煮5 min 变性。然后进行十二烷基-聚丙烯酰胺凝胶电脉（SDS-PAGE），半干法转膜、封闭1 h，一抗4 ℃孵育过夜、洗膜，二抗孵育2 h、洗膜，化学发光法显色，在成像仪上成像、拍照，用Image-Lab 软件读取各组条带灰度值。

1.2.5 CCK-8 法检测U251 细胞的增殖变化 按CCK-8 试剂盒方法进行细胞增殖检测。U251 细胞转染12h 后，将各组细胞消化重悬，调节细胞浓度至2 ×104 个／m L。按照100μL／孔的量接种于96 孔板，保证每孔含2000 个细胞，每个组设置5 个重复孔，分别检测转染后12、24、36、48、72h 共5 个时间点的吸光度值。

1.2.6 流式细胞仪检测细胞凋亡率的变化 各组细胞转染48 h 后，用不含EDTA的胰酶消化，2000 r pm离心5min 收集细胞沉淀；PBS 洗涤2次，再离心收集细胞沉淀并用500μL Binding Buffer 重悬细胞。向细胞悬液内加1μL Annexin VPE 混匀，室温下避光反应15 min。用美国BD公司流式细胞仪进行细胞凋亡检测，以未转染组U251 细胞进行荧光补偿调节（激发波长为488 nm；发射波长为578 nm），用FL2 通道检测各转染组细胞的凋亡率。

1.3 统计学处理 采用SPSS13.0 软件进行统计学分析，多组间比较采用one-way-ANOVA检验分析：首先做方差齐性检验，如果方差齐性，则组间比较采取LSD法。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 U251 细胞染转结果 细胞转染前，呈长梭形，边缘清晰，生长旺盛，结构正常。经脂质体转染24 h 后，用荧光显微镜观察可见基因沉默组和阴性对照组细胞内均有大量绿色荧光蛋白表达（表达率可达80%），说明21.5 k DaMBP基因干扰质粒p Genesil-1-MBP-3 和空质粒表达pGenesi l-1-MBP-neg 均已成功转入到U251 细胞中并在细胞中有效表达，见图1。

图1 U251 细胞转染前后细胞对比图

2.2 各组细胞中21.5 kDaMBP基因在m RN A水平的表达结果 各转染组细胞中MBP基因表达的RT-PCR检测结果见图2、3。图2 可见扩增产物的溶解曲线均可扩增出单峰，且3 次重复表现一致，表明扩增具有良好的特异性和重复性。图3 为各转染组细胞21.5 k DaMBP基因表达柱状图，各组实验数据经2-△△Ct转换和SPSS13.0 软件one-way-ANOVA检验分析，与阴性对照组相比，基因沉默组细胞内21.5 k DaMBP基因表达量降低了94.9%（P＜0.05）。

图2 各转染组21.5 k DaMBP mRNAs 扩增产物的溶解曲线

2.3 各组细胞中21.5 kDaMBP基因在蛋白质水平的表达结果Western bolt 检测显示，3 组细胞中内参照GAPDH的表达基本一致。但基因沉默组细胞中21.5 k Da MBP蛋白的表达水平显著低于阴性对照组和脂质体转染组；Image-Lab 软件分析显示，基因沉默组细胞中21.5 kDa MBP 蛋白表达的相对灰度值为0.833±0.007、阴性对照组为1.637±0.131、脂质体转染组为1.543±0.034。将所得出数据进行统计分析，方差齐性检验结果显示方差齐性（P＝0.067）；方差分析结果显示组间差异具有统计学意义（F＝762.277，P＜0.05）；LSD法进行两两比较，基因沉默组与其他两组相比，差异有统计学意义（P＜0.05）。Western bolt 检测结果显示，经沉默质粒pGenesil-1-MBP-3 转染，明显干扰了U251 细胞中21.5 k DaMBP基因的表达，细胞中21.5 kDa MBP 蛋白的表达量较阴性对照组降低了49.12%，见图4。

图3 21.5 k Da MBP基因在m RN A水平表达柱状图

图4 各转染组细胞中21.5 kDa MBP 的表达

2.4 CCK-8 法检测细胞增殖结果 阴性对照组和脂质体转染组的细胞生长曲线基本重叠，基因沉默组的细胞生长曲线明显向右移，表明基因沉默组的细胞生长速度变慢。基因沉默组细胞的OD值随转染时间的延长而增高，转染12、24、36、48、72 h 的OD值分别为（0.515±0.046）、（0.593±0.043）、（0.675±0.011）、（0.807±0.017）、（0.952±0.041），差异有统计学意义（P＜0.05），见图5。

图5 CCK-8 检测细胞增殖曲线

2.5 流式细胞仪检测转染后细胞凋亡率U251 细胞转染48 h后，各转染组的细胞凋亡率分别为：基因沉默组（6.16±0.525）%、阴 性 对 照 组（1.96±0.083）%、脂 质 体 转 染 组（0.96±0.115）%；方差齐性检验结果为P＝0.077，显示方差齐；方差分析结果为F＝231.704、P＜0.05，说明3 组间差异有统计学意义；用LSD法进行两两比较显示，与阴性对照组和脂质体转染组两组相比，基因沉默组的细胞凋亡率显著增高，差异有统计学意义（P＜0.05），见图6。

图6 流式细胞仪检测各组细胞凋亡图

3 讨 论

MBP 是一种含有多种碱性氨基酸的强碱性膜蛋白，主要分布在神经组织，在其他组织中含量极少，主要功能是维持神经纤维的绝缘和快速传导。近年研究发现，21.5 k Da MBP 在多种肿瘤组织细胞中高表达［9-10］；在人脑神经胶质瘤细胞中21.5 k Da MBP 的表达量更丰富［11-12］，提示21.5 k Da MBP可能在肿瘤细胞增殖及凋亡中发挥重要调节作用，可能与神经胶质瘤的发生、发展具有密切联系。

本研究构建了针对21.5 k Da MBP的特异性干扰重组质粒并经脂质体介导将其导入神经胶质瘤细胞，证实该质粒在神经胶质瘤细胞中可以显著降低21.5 k Da MBP的表达。通过细胞增殖实验与流式细胞凋亡检测发现，21.5 kDaMBP基因沉默能够显著抑制U251 的细胞增殖、促进细胞凋亡。

但神经胶质瘤细胞中的21.5 kDa MBP导致细胞增殖加快、凋亡减慢的机制尚不明确，有待进一步深入研究。业已证实，MBP 存在着磷酸化、脱磷酸两种形式，分别参与不同的代谢调节。例如，MBP 的磷酸化参与凋亡因子Fa s 蛋白类似物MT-21 及抗癌剂细胞三烯菌素A对HL-60细胞凋亡的诱导［13］，MBP 的磷酸化还参与髓鞘形成与稳定性调节及脱髓鞘疾病多发性硬化症的调节［14］。Chen 等［3］研究发现，在体外将MBP 微基因转染至肿瘤细胞（YTLMC-90）或正常细胞（成纤维细胞与平滑肌细胞）均可促进细胞增殖。本研究推测MBP、磷酸化MBP 的相对浓度改变可能是调节某些细胞增殖与凋亡的重要因素，MBP增高则细胞增殖，磷酸化MBP增高则细胞发生凋亡。线粒体Caspase激酶级联途径与真核细胞凋亡密切相关，Kobayashi 等［4］研究发现MBP可以降低DRG细胞中的Caspase-3而抑制细胞凋亡。Pan 等［5］研究检测到21.5 k Da MBP 转染的HepG-2 细胞中Caspase-3的表达量较对照组显著降低，说明MBP可能通过调节细胞中的凋亡蛋白而发挥抗凋亡作用。Smith 等［15］研究发现21.5 k Da MBP高表达可以促进N19-OLG细胞增殖，同时观察到细胞外调节蛋白激酶（ERK1／2）、蛋白激酶B1（AKt1）和核糖体蛋白S6（r PS6）表达上调，说明可能通过激活某些蛋白激酶及相关的信号通路促进细胞增殖。

21.5 kDa MBP的促细胞增殖与抗凋亡活性还可能与肿瘤细胞侵及周边神经组织和中枢神经系统的行为有关，这可能也是21.5 k Da MBP 在肺癌、乳腺癌等多种非神经系统肿瘤组织中异位高表达的原因所在。因为MBP是神经髓鞘化过程非常重要的蛋白质，从基因上将实验老鼠剔除MBP后，发现它们减少了中央神经系统的髓鞘化及渐进的失调，如颤抖、癫痫及过早死亡。因此，MBP对正常的神经细胞形态及功能的维持是必需的，而在癌细胞中表达增强是其分化和增殖失控的结果还是调控的一个关键点，仍有待进一步深入研究。

本研究从基因沉默的角度证实了21.5 kDa MBP具有促进细胞增殖与抑制细胞凋亡的双重调节功能，并从基因干扰的角度为肿瘤的基因治疗进行了一次有益的尝试。本研究构建的21.5 k Da MBP 特异性干扰重组质粒，为进一步研究21.5 k Da MBP 的功能及神经胶质瘤的基因治疗提供了一种可供选择的物质手段。

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