李 凡，薛春梅，赵 晔，张跃华，李佳琳，杜春梅，赵永勋*

(1.佳木斯大学生命科学学院，黑龙江佳木斯 154007；2.北京碧水源膜科技股份有限公司，北京 101407)



四种香蘑属真菌子实体抗氧化活性比较分析

李 凡1，薛春梅1，赵 晔2，张跃华1，李佳琳1，杜春梅1，赵永勋1*

(1.佳木斯大学生命科学学院，黑龙江佳木斯 154007；2.北京碧水源膜科技股份有限公司，北京 101407)

[目的] 为了评价4种香蘑属真菌的抗氧化活性。[方法] 对4种香蘑属真菌子实体微波水提物进行抗氧化活性比较分析。[结果] 灰褐香蘑(Lepistaluscina)、白香蘑(Lepistacaespitosa)、紫丁香蘑(Lepistanuda)、花脸香蘑(Lepistasordida)4种香蘑子实体提取物对二苯基苦味酰基苯肼自由基(·DPPH)和羟自由基(·OH)的清除作用较显著，对·DPPH的清除率依次达到73.9%、59.2%、80.7%和82.8%；对·OH的清除率分别达到92.5%、95.7%、83.6%和94.4%。这4种真菌子实体提取物对超氧阴离子亦有一定的清除作用。[结论]4种香蘑真菌子实体中可能存在着活性较强的天然抗氧化活性物质。

香蘑属真菌; 抗氧化活性; DPPH; 羟自由基; 超氧阴离子

现代研究表明，许多疾病如心脑血管疾病、癌症以及人体衰老等过程都与自由基过剩有关[1]。自由基是生物体内生物化学反应的普遍介质，是带有不配对电子的原子、原子团或分子如羟自由基、超氧阴离子自由基等，可直接损伤各种生物膜，导致多种疾病的发生[2]。因而，如何开发利用抗氧化活性物质调节体内代谢、延缓衰老、预防疾病等问题已引起人们的广泛关注。国内外的许多研究证明，很多大型真菌子实体和发酵产物中多含有抗氧化活性物质[3-6]。这表明大型真菌可能是提取天然、安全的抗氧化活性物质的理想原料。

香蘑属(Lepista)真菌隶属于真菌门(Eumycota)担子菌纲(Basidiomysetes)伞菌目(Agaricales)口蘑科(Tricholomatceae)。我国已发现有12种[7]。到目前为止，关于香蘑属真菌子实体提取物抗氧化活性的比较研究未见报道。笔者主要通过制备灰褐香蘑[Lepistaluscina(Fr.) Sing.]、白香蘑[Lepistacaespitosa(Bres.)Sing.]、紫丁香蘑[Lepistanuda(Bull.:Fr.)Cooke]、花脸香蘑[Lepistasordida(Fr.)Sing]等4种常见香蘑子实体提取物，测定其清除·DPPH、·OH以及超氧阴离子的能力，评价这4种香蘑属真菌的抗氧化活性，并且进行比较分析。

1 材料与方法

1.1 试验材料供试灰褐香蘑、白香蘑、紫丁香蘑、花脸香蘑均为野生香蘑，采集于黑龙江省佳木斯市周边林场。

1.2 提取液的制备[8]将采集的白香蘑、灰褐香蘑、紫丁香蘑、花脸香蘑放入干燥箱中烘干，准确称取烘干后这4种香蘑各5.0 g，放入烧杯中，按料液比1∶20加双蒸水至10.00 ml，用玻棒搅拌均匀，同时放入微波炉中，调至300 W输出档，定时1 min，取出，8 000 r/nmin离心4 min，取上清液，即为这4种香蘑的提取液。将这4种香蘑的提取液分别稀释至0.5、1、2、4、6、8、10 mg/ml的浓度梯度，4 ℃冰箱保存，备用(保存时间最好不超过72 h)。

1.3 指标测定与方法

1.3.1清除·DPPH能力的测定[9]。精确称取DPPH试剂0.015 8 g,用无水乙醇溶解，并定容至200.0 ml，使其浓度为200 μmol/L,避光保存(该溶液最好现配现用)。准确吸取各浓度样品溶液2.0 ml与2.0 ml DPPH溶液,加入同一具塞试管中，充分混匀，37 ℃恒温水浴暗反应30 min后，于波长517 nm处测定吸光度(Ai)，以无水乙醇调零。每个样品平行测定3次，取平均值。按以下公式，计算各待测样品对DPPH自由基的清除率。

式中，Ai为2.0ml样品溶液与2.0mlDPPH试剂混合液的吸光度；Aj为2.0ml样品溶液与2.0ml空白溶剂(无水乙醇)混合液的吸光度；Ao为2.0mlDPPH溶液与2.0ml溶剂混合液的吸光度。

1.3.2清除·OH能力的测定[10-12]。采取邻二氮菲-Fe2+法测定羟基自由基的清除率。吸取 1.5 ml 5 mmol/L 邻二氮菲应用液，加入4 ml pH 7.4磷酸钠缓冲液，再加入1.0 ml 7.5 mmol/L FeSO4溶液，立即混匀。加入1 ml某一浓度的样品溶液，立即混匀。加入 1.5 ml双蒸水以补充体积，最后加入1.0 ml浓度1% H2O2溶液，以双蒸水代替H2O2溶液作为空白对照，轻轻混匀。37 ℃保温 90 min，于 536 nm测定吸光度。

·OH清除率计算公式为：

式中，Ai为加入样品(子实体提取液)及H2O2；Aj为加H2O2而不加样品；As为两者都不加；Ao为空白对照。

1.3.3清除超氧阴离子(·O2-)能力的测定[10-12]。取pH为8.2的Tris-HCl缓冲液6.0 ml，加入不同浓度的样品0.5 ml，37 ℃水浴 10 min，最后加入 37 ℃预热过的7 mmol/L PR(邻苯三酚盐酸溶液 )1.0 ml，混匀后反应4 min，用0.5 ml浓盐酸终止反应，测定325 nm处吸光度(A)以等体积pH为8.2的Tris-HCl缓冲液为空白吸光度(A0)。蒸馏水调零。

式中，A(试样)为试样组在波长325nm的吸光度；A0为空白组在波长325nm的吸光度值。

2 结果与分析

2.1 ·DPPH清除率的比较对这4种香蘑属真菌子实体的水提物清除·DPPH的能力进行双因素方差分析。从图1可以看出，这4种香蘑属真菌子实体的水提物都有一定清除·DPPH的能力。在一定程度上，随着子实体提取物浓度的增加，清除·DPPH的能力也在升高。当质量浓度为4.00 mg/ml时，灰褐香蘑、白香蘑、紫丁香蘑和花脸香蘑的·DPPH清除率均达到较大值，分别为70.5%、58.6%、80.4%和80.5%。·DPPH去除能力强弱顺序为花脸香蘑>紫丁香蘑>灰褐香蘑 >白香蘑。在0.50～4.00 mg/ml浓度梯度范围内，·DPPH清除率随着浓度的升高而增加。当质量浓度为6.00 mg/ml时，花脸香蘑的清除率最大，达到82.7%。在6.00～10.00 mg/ml浓度梯度范围内，随着浓度的增加，4种香蘑的·DPPH清除率均有些许的降低。在0.50～10.00 mg/ml浓度梯度范围内，同种香蘑不同浓度梯度·DPPH清除率均有显著差异。在提取物浓度相同的情况下，不同香蘑清除·DPPH能力之间存在差异，但白香蘑均与其他3种香蘑之间有显著性差异。

2.2 清除·OH能力的比较从图2可以看出，4种香蘑属真菌子实体均有很强的清除·OH能力，在0.50～10.00 mg/ml浓度梯度范围内对·OH的清除能力均随提取物质量浓度的增加而升高。当质量浓度为4.00 mg/ml时，去除能力强弱顺序为花脸香蘑>白香蘑>灰褐香蘑>紫丁香蘑。当质量浓度为10 mg/ml时，白香蘑的清除率最大，达到94.9%。在提取物浓度相同的情况下，不同香蘑·OH的能力均存在差异，但白香蘑均与其他3种香蘑之间的清除率均有显著差异。

2.3 清除超氧阴离子能力的比较由图3可知，4种香蘑属真菌子实体对邻苯三酚自氧化均有抑制作用，在一定质量浓度范围内对超氧阴离子的清除能力均随提取物质量浓度的增加而升高。在所测样品中，白香蘑具有较强的清除超氧阴离子的能力，并且随着浓度的升高而增加。当质量浓度为4.00 mg/ml时，清除超氧阴离子能力的强弱顺序为花脸香蘑>白香蘑>灰褐香蘑>紫丁香蘑。而当质量浓度为10.00 mg/ml时，白香蘑的清除率最高，达到25.4%。在0.50～4.00 mg/ml浓度梯度范围内，各香蘑属真菌间的清除率无显著差异，但随着质量浓度的升高，紫丁香蘑与其他3种香蘑的清除率均有显著性差异。这可能与紫丁香蘑的药用成分有关。

3 讨论

目前，食品安全成为全世界关注的话题。人工合成抗氧化剂存在潜在的致癌作用，以天然抗氧化剂取代合成抗氧化剂是食品行业的发展趋势[13]。传统食用菌因含有多种抗氧化成分，受到人们的青睐，而对于那些珍惜的野生食用菌，科学家对其进行系统性抗氧化活性比较分析的研究较少。

研究表明，灰褐香蘑、白香蘑、紫丁香蘑、花脸香蘑4种香蘑属真菌子实体微波处理水提取物对·DPPH和·OH的清除作用比较显著，其中对·DPPH的清除率分别达到73.0%、58.6%、80.0%和82.7%，花脸香蘑的清除能力最强；对·OH 的清除率分别达到91.0%、94.8%、82.3和90.3%，白香蘑的清除能力最强。4种香蘑属真菌子实体的水提物对超氧阴离子均有一定的清除作用，分别达到17.3%、25.4%、14.8和17.5%，白香蘑的清除能力最强。这4种香蘑真菌子实体中可能存在着活性较强的天然抗氧化活性物质，推测其水提物中含有较多亲水性抗氧化活性物质。该研究没有对这4种香蘑属真菌子实体中的抗氧化活性物质进行进一步的分离纯化，所以不能确定抗氧化活性物质的具体成分，有待于今后进行深入研究。

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A Comparative Analysis on Antioxidant Activity for Four Kinds ofLepistaepiphyte

LI Fan1, XUE Chun-mei1, ZHAO Ye2, ZHAO Yong-xun1*et al

(1.College of Life Science, Jiamusi University, Jiamusi, Heilongjiang 154007；2. Beijing Origin Water Membrane Technology Co. Ltd, Beijing 101407)

[Objective] The research aimed to evaluate the antioxidant activity of four kinds ofLepistaepiphyte. [Method] The comparative analysis for anti-oxidant activity of fungi microwave water extracts of the four fragrant mushroom fruiting bodies was carried out. [Result] Fungi microwave water extracts ofLepistaepiphyte,Lepistaluscina,Lepistacaespitosa,LepistanudaandLepistasordidashowed significant clearance ,which was 73.0%, 73.0%, 58.6% and 73.0% respectively to ·DPPH and 91.0%, 94.8%, 82.3% and 91.0% respectively to ·OH in the microwave processed water extract of their fruiting body. Moreover, the fruiting body extracts of the four kinds of fungus showed a clear effect on superoxide anion. [Conclusion] Fruiting body of four kinds ofLepistaepiphytemight contain natural antioxidant substances.

Lepistaepiphyte; Antioxidant activity; DPPH; Hydroxyl free radicals; Superoxide anion

黑龙江省教育厅科学技术研究面上项目(12531696)。

李凡(1989-)，女，山东阳谷人，硕士研究生，研究方向：微生物学。*通讯作者，教授，硕士生导师，从事真菌生物化学方面的研究。

2014-12-15

S 646

A

0517-6611(2015)04-015-03