夏 泽，姜 贺，李洪龙

(延边大学农学院，吉林延吉 133002)



MS糖对鸡源乳酸杆菌生物学特性的影响

夏 泽，姜 贺，李洪龙*

(延边大学农学院，吉林延吉 133002)

[目的] 为MS糖在饲料添加剂中的应用提供可靠的理论依据。[方法]从健康成年鸡肠道中分离乳酸杆菌, 并进行生理生化指标测定，研究在体外培养条件下MS糖对鸡源乳酸杆菌生物学特性的影响。[结果] MS糖添加量3%～6%是乳酸杆菌生长最适的浓度范围。当MS糖添加量为4%时，乳酸杆菌产酸速率相对较快，产酸量有所提高，耐酸性和耐热性均显著增强。[结论] MS糖对乳酸杆菌的生物学特性有一定的影响，作为一种新型的功能性低聚糖在家禽饲养中具有广泛的开发前景。

MS糖；乳酸杆菌；生理生化指标；生物学特性

MS糖由韩国Mexcell Bio 研究所研制成功并于2013年申请专利(专利号：10-1302119)，是一种提高体内营养物质吸收率的辅助食品用功能液。同时，是一种制作工艺简单，价格低廉并具有广泛开发前景的新型功能性低聚糖，其显著功能之一是具有活化肠内有益菌，促进其代谢产物的吸收和利用及抑制病原微生物在肠壁的附殖。乳酸菌是畜禽肠道中的优势菌群之一，由于乳酸菌在其生长过程中产生的乳酸菌素具有改善畜禽胃肠道功能、提高免疫力、改善机体营养状况等作用，因此乳酸菌在畜禽消化道中出现和定植的早晚是机体生长和对疾病抵抗力的重要因素[1-4]。但是，在自然环境条件下大部分乳酸菌的定植能力差，对外界环境的耐热性及耐酸性不强，这就限制其发挥有效的生物学功效[5]。因此，笔者从成年健康鸡肠道中分离优化乳酸杆菌后，在体外培养条件下添加不同浓度梯度的MS糖，研究其最适浓度范围内的MS糖对乳酸杆菌的生长曲线、产酸性、耐酸性及耐热性等生物学特性的影响，以期为今后MS糖作为新型功能性低聚糖的一种被广泛应用于饲料添加剂提供可靠的理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1培养基。①MRS培养基：七水硫酸镁0.58 g、四水硫酸锰0.25 g、柠檬酸氢二铵2 g、磷酸氢二钾2 g、乙酸钠5 g、蛋白胨10 g、葡萄糖20 g、酵母膏5 g、牛肉膏10 g、吐温 80 1 ml。以上组分加入1 000 ml蒸馏水即为液体培养基，另加入适量琼脂粉，即制成固体培养基。pH为6.2～6.4。灭菌条件为：121 ℃，15 min。②乳酸菌筛选培养基(2%CaCO3-MRS固体平板)：普通固体 MRS 培养基的基础上加 2%的无水碳酸钙，115 ℃下灭菌 20 min。

此外，明胶基础培养基、硫化氢试验培养基、淀粉培养基、各类糖发酵培养基等生理生化鉴定培养基均按照文献[6]中方法配制。

1.1.2生化试剂。革兰氏染色试剂、双氧水、甲基红指示剂等。以上所用培养基和试剂均按照乳酸菌要求在实验室内配制。

1.1.3MS糖。MS糖由韩国Mexcell Bio 研究所提供。

1.2 试验动物3月龄健康三黄鸡3只，购自延吉市西市场。

1.3 方法

1.3.1测定指标与方法。

1.3.1.1乳酸杆菌的分离。按照以下步骤分离乳酸杆菌：解剖—采样—处理—稀释—涂板—鉴别—革兰氏染色镜检—纯化培养。

1.3.1.2生理生化指标的测定。将分离到的菌种分别进行明胶液化试验、触酶试验、甲基红试验、硫化氢试验、淀粉水解试验、运动性试验、糖酵解反应(葡萄糖、甘露醇、蔗糖、纤维二糖、棉籽糖、水杨苷、七叶苷、麦芽糖)等，进行菌种的初步鉴定。

1.3.1.3MS糖添加量最适范围的测定。菌种活化后，按5%的接种量分别接种于含有不同浓度的MS糖(0、0.1%、0.2%～0.9%、1%～10%)共20个浓度梯度的MRS液体培养基中，37 ℃下厌氧培养24 h后用分光光度计测定OD600值。以OD600均值为纵坐标，以MS糖浓度为横坐标，绘制浓度曲线。

1.3.1.4生长曲线的绘制。菌种活化后，按5%的接种量分别接种于含有不同浓度(0、最适浓度范围)MS糖的MRS液体培养基中，每组3个重复，37 ℃下厌氧培养，每隔2 h取样1次，使用分光光度计测定OD600值。以OD600均值为纵坐标，以时间为横坐标，绘制生长曲线。

1.3.1.5产酸性的测定。菌种活化后，按5%的接种量分别接种于含有不同浓度MS糖的MRS液体培养基中，每组3个重复，37 ℃下厌氧培养，每隔2 h取样1次，使用酸度计测定pH值。以pH均值为纵坐标，以时间为横坐标，绘制产酸性曲线图。

1.3.1.6耐酸性试验。菌种活化后，按5%的接种量分别接种于含有不同浓度MS糖的MRS液体培养基中，将培养基pH调整为2.0和6.8，每组3个重复，分别培养2、4、6、8 h后取样200 μl，稀释后取 10-4、10-5、10-6倍稀释液，分别涂布 MRS平板培养，37 ℃下厌氧培养24 h后进行平板法计数，计算活菌率。

N酸(%)=nx/n0×100%

(1)

式中,N酸为经过pH 2.0处理后不同时间的乳酸杆菌存活率；n0为经过pH 6.8处理2、4、6、8 h后涂布的每毫升活菌数；nx为经过pH 2.0处理2、4、6、8 h后涂布的每毫升活菌数。

1.3.1.7耐热性试验。菌种活化后，按5%的接种量分别接种于含有不同浓度MS糖的MRS液体培养基中，每组3个重复，37 ℃厌氧培养24 h后分别置于40、60和80 ℃，3个梯度的水浴中，均处理10、20、30 min后取样200 μl，稀释后取 10-4、10-5、10-6倍稀释液，分别涂布 MRS平板培养，37 ℃下厌下氧培养24 h后进行平板法计数，计算活菌率。

N热(%)=nx/n0×100%

(2)

式中,N热为经过40、60、80 ℃处理后不同时间的乳酸杆菌存活率；n0为经过40、60、80 ℃处理前涂布的每毫升活菌数；nx为经过40、60、80 ℃处理后涂布的每毫升活菌数。

1.3.2数据处理。试验数据用Excel软件整理和绘图，并使用SPSS17.0统计软件进行单因素方差分析，P<0.05差异显著，结果用平均值±标准差表示。

2 结果与分析

2.1 乳酸杆菌的分离与形态学观察经溶钙圈法筛选出的菌株在纯化培养后的菌落呈乳白色，边缘整齐， 半球凸起实心， 表面光滑，菌落较小。革兰氏镜检结果为阳性，染色后呈蓝紫色，菌体呈长杆状，无芽孢，不运动，稍弯曲，成对或单个存在(图1)。

2.2 乳酸杆菌的生理生化鉴定结果乳酸杆菌的生理生化鉴定结果见表1。

表1 乳酸杆菌的生理生化鉴定结果

注：“+”表示90%以上菌株为阳性，“-”表示90%以上菌株为阴性。

2.3 MS糖添加量的最适范围从图2可以看出，MS糖为0.1%～2.0%浓度时，OD值都明显低于对照组，且不稳定，从3.0%浓度时开始逐步上升，并有明显波峰，当MS糖6.0%浓度时呈逐渐稳定下降趋势，因此初步确定最适合乳酸杆菌生长的MS糖添加量范围为3.0%～6.0%。

2.4 生长曲线从图3可以看出，MS糖浓度为4%时，OD值始终高于其他组，说明产菌量最多，且从4 h后OD值明显增长，直到16 h后OD值逐渐稳定在2.18左右，而对照组在最高时OD值仅在1.9左右，与其他组相比较低，说明添加不同浓度的MS糖可使乳酸杆菌的产菌量提高。

2.5 产酸性从图4可以看出，在培养的不同阶段，MS糖浓度为4%与5%组的pH均低于对照组，且二者基本相同，3%组与6%组pH基本相同，但与对照组差异不大；各组基本均从4 h开始进入加速期，16 h后进入恒定期，但添加量为4%浓度时，曲线下降较快，说明其产酸速率较其他组稍快，当添加量为5%时产酸量较多，pH最低值趋近于3，说明添加MS糖对乳酸杆菌的产酸性稍有影响。

2.6 耐酸性试验由表2可知，随着时间的推移，各组存活率均下降，当培养液pH为2，培养2 h后试验2组与对照组和试验4组差异显著，分别提高了9.13%和7.70%；4 h，对照组与试验各组之间均差异显著，各试验组之间差异不显著；6 h，试验1、2和4组较对照组存活率分别提高了43.38%、47.21%和36.38%，差异显著；8 h，试验2组存活率达到14.42%，与对照组、试验1组和试验4组均差异显著，对照组与试验1组合试验3组差异不显著。

表2 不同添加量MS糖对乳酸杆菌耐酸性的影响 %

注：同列不同小写字母表示差异显著(P﹤0.05)。

2.7 耐热性试验由表3可知，随着温度与时间的增加，各组存活率均降低，经40 ℃水浴处理 10、20和30 min 后，各菌株的存活率均在 95%以上；经60 ℃处理 10 min 后，各组之间存活率相似，差异不显著；经60 ℃处理 20 min 后，对照组存活率仅为21%，与其他组差异显著；经60 ℃处理 30 min 后，试验组与对照组差异显著，分别提高了160%、140%、146%和99.9%；经80 ℃处理10 min后，对照组存活率为0，与试验组差异显著，试验2组存活率达到4.33%，比其他试验组差异显著；经80 ℃处理20 min后，试验2组存活率为1.33%，其他组存活率均为0，差异显著；经80 ℃处理30 min后，各组存活率为0。

表3 不同添加量MS糖对乳酸杆菌耐热性的影响 %

注：同列不同小写字母表示差异显著(P﹤0.05)。

3 结论与讨论

国内外研究表明，乳酸杆菌为鸡消化道内优势菌群之一。它是兼性厌氧菌，无氧或较低的氧分压环境下在固态基质表面生长；最适生长温度为35～38 ℃，20 ℃以下基本不生长，耐热性差；最适 pH 为 5.5～6.0，耐酸性强，能在其他乳酸菌不能生长的环境中生长繁殖；营养要求复杂，需要氨基酸、肽、核酸衍生物、盐类脂肪酸或脂肪酸脂类和可发酵的碳水化合物，能利用葡萄糖、果糖、乳糖和蔗糖等一些单糖和寡糖进行同型发酵，发酵产生 DL 型乳酸。乳酸杆菌生长繁殖需要一定的维生素等生长因子，适宜生长温度下培养生长缓慢，生产周期长[7]。由于人体或动物消化道内没有可以降解功能性低聚糖的酶，因此功能性低聚糖不能被人体或动物消化道内的酶降解而顺利到达大肠，选择性地促进肠道内有益菌双歧杆菌、乳酸菌的增殖，抑制有害菌大肠杆菌等的增殖[8]。笔者从健康鸡肠道中分离细菌，经形态学观察及生理生化鉴定发现明胶液化试验、触酶试验、甲基红试验、硫化氢试验、淀粉水解试验、吲哚试验及除麦芽糖酵解外的糖酵解反应结果都呈阴性，因此初步鉴定其为乳酸杆菌；在体外培养条件下首先确定MS糖添量的最适浓度范围在3%～6%，结果表明浓度过低时与对照组差别不大，浓度过高的MS糖对乳酸杆菌的生长稍有抑制作用，因对MS糖作用机制的报道国内尚未见报道，但大多低聚糖都存在这样的情况，这与万荣峰等[9]的研究结果相似，可能是因为高浓度的低聚糖在培养基中形成了高的渗透压，对细菌产生了一定的脱水作用，抑制了其生长，浓度过低促进作用又不明显；随后分别对其生长曲线和产酸性进行测定，结果表明，无论是产菌量还是产酸性，都在培养的4～16 h有较快增长，从16 h后逐渐进入稳定期，与对照组相比试验组OD600值更高，尤其当添加量为4%时，OD600值最高可达2.18，pH值稳定在3.2左右，表明产菌量增加，产酸更快，产酸量更多，这与杭苏琴等[10]研究结果相一致；在耐酸性试验中，尽管培养液pH为2，但在培养初始的2 h内，对照组与试验组存活率均能达到90%左右，差别不大，随着时间的增加，各组的菌株存活率成倍数下降；到第8 h只有MS糖添加量为4%时，存活率达到14.42%，其他组均在10%以下，对照组更低至于1.24%，与大多数研究[11-13]相比,也是具有较好的耐受性。这说明添加适量的MS糖可显著提高乳酸杆菌的耐酸性；在耐热性试验中，大多数研究表明最适乳酸杆菌生长温度为 35～38 ℃[14]，因此此次试验共设置40、60和80 ℃ 3个温度梯度培养菌株，在40和60 ℃水浴中，乳酸杆菌均表现出较好的生长状态，在80 ℃水浴中20 min后，存活率基本为0，仅在MS糖添加量为4%时，存活率为1.33%，说明此次分离出的乳酸杆菌有对热较高的耐受性，这与周明等[15]的研究结果相一致，而且添加适量的MS糖后使乳酸杆菌对热的耐受能力更强。

笔者初步确定MS糖添加量为3%～6%是乳酸杆菌生长最适的浓度范围。当添加量在4%时，其产酸速率明显加快，产酸量也有提高，耐酸性和耐热性均有显著增强。这说明MS糖对乳酸杆菌的生物学特性有一定的影响，作为一种新型的功能性低聚糖在家禽饲养中具有广泛的开发前景。

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Effect of MS Oligosaccharides on the Biological Characteristics of Lactobacillus from Chicken

XIA Ze, JIANG He, LI Hong-long*

(Agricultural College of Yanbian Universit, Yanji， Jilin 133002)

[Objective] The research aimed to provide reliable theoretical basis for the application of MS oligosaccharides in feed additive. [Method] Lactobacillus was separated from the intestinal tract of adult health chicken. And their physiological and biochemical indices were determined. The effects of MS oligosaccharides on the biological characteristics of Lactobacillus from chicken under culture conditions in vitro were studied. [Result] The suitable adding amount of MS oligosaccharides for the growth of Lactobacillus was 3%-6%. When the adding amount of MS oligosaccharides was 4%，the acid production rate of Lactobacillus was faster，acid production increased and acid resistance and heat resistance were significantly enhanced. [Conclusion] MS oligosaccharides had some effects on the biological characteristics of Lactobacillus. MS oligosaccharides could be used as a new kind of functional oligosaccharide in the breeding of poultry, which had a broad development foreground.

MS oligosaccharides; Lactobacillus; Physiological and biochemical indices；Biological characteristics

夏泽(1990-)，女，吉林农安人，硕士研究生，研究方向：低聚糖的生物活性及应用。*通讯作者，教授，博士，硕士生导师，从事动物营养方面的教学与科研工作。

2014-12-15

S 181.3

A

0517-6611(2015)04-089-04