草酸钙肾结石大鼠肾组织Tamm-Horsfall蛋白表达及温肾化石汤调节*

*基金项目：江西省自然科学基金项目(20122BAB205082)。

摘要：目的：研究草酸钙肾结石大鼠肾组织TH蛋白的表达，并用中药温肾化石汤调节，探讨该方防治肾结石复发的作用机制。方法：雄性SD大鼠60只，随机分为对照组、肾结石组、温肾化石汤组，每组各20只，肾结石组和温肾化石汤组以含有0.5%的乙二醇和0.5%的氯化铵的混合溶液致石剂代替饮用水，温肾化石汤组同时每日灌服中药温肾化石汤，二周后处死大鼠，解剖观察肾脏剖面结石形成，并用免疫组织化学法测定肾组织TH蛋白的相对表达量。结果：肾结石组肾脏成石程度最重，与温肾化石汤组比差异显著，对照组肾组织TH蛋白表达最强，其次为温肾化石汤组，肾结石组，三组相比差异显著。结论：TH蛋白可以抑制肾结石形成，中药温肾化石汤可以恢复大鼠肾组织TH蛋白表达量，推测此可能为该方防治肾结石复发的重要作用机制。

关键词：肾结石；TH蛋白；温肾化石汤

肾结石发病率高，治愈后复发率高，故研究肾结石的病因病机，寻求有效的防治方法，成为国内外泌尿外科研究的重要课题[1]。Tamm-Horsfall(TH)蛋白是尿中主要的粘蛋白，研究发现其可影响草酸钙结石成核、生长、聚集及其与肾上皮细胞粘附，与肾结石形成密切相关[2]。临床研究发现中药温肾化石汤对肾结石形成与复发具有良好防治作用[3]。研究实验性草酸钙肾结石模型肾组织中TH蛋白的表达，并用中药温肾化石汤进行调节,从中、西医角度进一步探讨含钙肾结石的形成机制，阐明温肾化石汤的防治机理。

1材料与方法

1.1实验动物与分组雄性SD大鼠60只，SPF级，购于湖南斯莱克景达实验动物有限公司，许可证号:SCXK(湘)2011-0003，体重250g左右。随机分成对照组、肾结石组、肾结石加温肾化石汤组(简称中药组)，每组20只。

1.2草酸钙肾结石动物模型制作[4]以含有0.5%的乙二醇和0.5%的氯化铵的混合溶液为致石剂代替饮用水，二周后处死大鼠，解剖肾脏，解剖显微镜下即可观察到肾脏剖面有肾结石形成。

1.3中药温肾化石汤制备熟地12g, 山药10g，山茱萸10g，泽泻10g，茯苓10g，丹皮10g，桂枝6g，制附片6g，金钱草16g，茜草10g。凉水浸泡40min后煎煮2次，每次30min，两次煎液合并，浓缩至100mL，含生药1g/mL。4℃冰箱保存备用。全部中药均购自江西省中医药大学附属医院中药房。

1.4处理方法对照组只喂普通净化饮用水，肾结石组与中药组以致石剂代替饮用水，中药组同时灌服温肾化石方煎剂1mL/100g体重，每天灌胃一次。为使三组大鼠实验条件保持一致，对照组与肾结石组每日同时用等量净化水灌胃1次。二周后处死大鼠，解剖取出肾脏，沿肾门长轴剖开，部分肾组织用10%甲醛固定，其余肾组织用解剖显微镜观察肾脏表面形态、肾剖面结石形成情况，以肾脏剖面有无明显结晶沉淀物、游离结石作为判断有无结石的标准。并根据结晶结石形成的量分为四级，进行统计分析。

1.5观察指标

1.5.1大鼠肾脏成石观察根据解剖显微镜观察肾脏表面和剖面结石、结晶形成量的多少分为四级。0级:表面和剖面无结石、结晶形成；1级:表面与剖面有少量结石、结晶形成，每个视野3个以下；2级:表面与剖面可见较多结石、结晶，每个视野3至5个；3级:表面与剖面见多量结石、结晶形成，每个视野5至10个；4级:表面与剖面皮、髓质内均见大量结石、结晶形成，每个视野10个以上。

1.5.2肾组织TH蛋白表达[5]采用免疫组织化学法测定肾组织TH蛋白的相对表达量。使用BOSTER公司生产的SV0002-兔IgG两步法免疫组化检测试剂盒，按其说明操作进行。顺序为甲醛固定肾组织脱水浸蜡包埋，3μm厚切片，3.3%H2O2,室温10min以灭活内源性酶，蒸馏水洗2min 3次。滴加封闭液,室温10min，甩去多余液体, 滴加适当稀释的一抗(兔IgG)，20～37 ℃ 1～2 h，0.01M PBS 洗2min 3次，滴加聚合HRP标记抗兔IgG(SV-0002)， 37℃孵育30min，PBS冲洗，2min 3次，DAB显色试剂盒(AR1022)显色，苏木素轻度复染、脱水,透明,封片、光学显微镜下观察，染色呈深棕黄色为+++，黄色为++，浅黄色为+，对其分级进行统计分析。

1.6统计学处理使用SPSS13.0 for windows专业统计软件，采用KrusKal-Walls非参数检验对三组大鼠肾脏成石程度和肾脏TH蛋白表达强度进行统计分析，采用Mann-Whitney非参数检验对三组大鼠肾脏成石程度和肾脏TH蛋白表达强度进行两两比较，检验水准α为0.05。

2结果

2.1肾脏成石分级概况见表1。结果所示，对照组与其它二组大鼠肾脏成石程度差异极为显著(P﹤0.01)，中药组与肾结石组大鼠肾脏成石程度差异显著(P﹤0.05)。肾结石组肾脏成石程度最重，表明本模型致石率高，中药组肾脏成石程度要轻，表明中药温肾化石汤可防治草酸钙肾结石形成。

表1　肾脏成石分级比较

注：与对照组比较**P﹤0.01；与肾结石组比较#P﹤0.05。

2.2肾组织TH蛋白表达见表2。结果所示，对照组肾组织TH蛋白表达最强，其余二组与其比较差异极为显著(P﹤0.01)，中药组比肾结石组肾组织TH蛋白表达强度要强，二组相比差显著(P﹤0.05)。

表2　肾组织TH蛋白表达强度比较

注：与对照组比较**P﹤0.01；与肾结石组比较#P﹤0.05。

3讨论

3.1肾结石与TH蛋白尿过饱和度增高、抑制活性下降、促进活性增强和颗粒滞留是尿石形成的四个主要因素[6]。肾石形成抑制物和促进物正常情况下二者处于一个动态平衡，当促进物增加，抑制物减少，则尿中即可形成尿石。Tamm-Horsfall(TH)蛋白是尿中主要的粘蛋白，其可影响肾石主要矿物草酸钙结石成核、生长、聚集及其与肾上皮细胞粘附[7]，故TH蛋白与肾石形成密切相关[9]。本研究结果显示，草酸钙肾结石大鼠肾组织中TH蛋白的表达下降，与对照组相比，差异极为显著，TH蛋白可以抑制草酸钙肾结石的形成，可以认为是结石形成的主要抑制物。

3.2温肾化石汤调节TH蛋白肾结石属中医石淋、腰痛、血尿等病范畴。《素问·阴阳应象大论》谓“阳化气，阴成形”，张景岳释“阳动而散，故化气；阴静而凝，故成形”。临床发现肾结石复发的患者未发病时平素多表现为形寒肢冷、腰膝酸软、舌淡、脉沉细等肾阳亏虚之候[9]，肾阳亏虚，阴寒凝聚是肾结石形成的中医病机，下焦湿热其实是肾石形成之后的病理产物[10]。本研究方中金匮肾气丸温肾化气治肾阳亏虚之本，金钱草、茜草清利湿热，活血化瘀，以防结石形成之湿、热、瘀之标，温肾化气，活血利尿，标本兼治。实验研究显示，肾结石组大鼠肾组织中TH蛋白表达减弱，加用中药温肾化石汤后肾组织中TH蛋白表达明显增强，肾脏结石、结晶形成明显减少，与肾结石组比差异极为显著。推测温肾化石汤防治肾结石形成机制可能是通过恢复结石形成抑制物TH蛋白的表达量，从而抑制尿中结晶的成核、生长、聚集。

参考文献

[1]Worcester EM.Inhibitors of stone formation[J].semin Nephrol,1996,16:474-86.

[2]陈庆海.尿微量蛋白检测及临床应用的研究进展[J].国外医学临床生物化学与检验学分册，2002,23(3)：178.

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[4]苗明三.实验动物和动物实验技术[M].北京：中国中医药出版社，1997：237-262.

[5]鲍华英，钱倩，姜新猷.TH蛋白在肾组织中的定位观察及其意义[J].南京医学院学报，1993；13(2)：141-143.

[6]张天申. 全国第二次尿结石会议综述[J].中华泌尿外科杂志，1981，2(2):123-127.

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[10]陈宝国，邱丽瑛，胡羽健，等.肾阳虚证与尿石形成相关性及温肾化石汤调节[J].时珍国医国药，2012，23(12)：3 076-3 077.

Tamm-Horsfall Protein Expression in Renal Tissue of Rats with Calcium Oxalate Stones and the Regulation of Wenshen Huashi Decoction

YANG Liu, CHEN Bao-guo, QIU Li-ying, YE Jing, LIU Cui-fang

TheaffiliatedhospitalofJiangxiUniversityofTCM,Nanchang330006,China.

Abstract:To study the expression of TH-protein in Renal Tissue of Rats with Calcium Oxalate Stones and the regulation of Wenshen Huashi Decoction, and explore the mechanism of prevention and cure the recurrence of kidney stones for this therapy. Method:60 male SD rats were randomly divided into three groups, which were control group, kidney stone group, Wenshen Huashi Decoction group, each group of 20 rats. Instead of drinking water, kidney stones group and Wenshen Hua shi Decoction group drunk the mixed solution which lead to stone water that were contain 0.5% of glycol and 0.5% of ammonium chloride, at the same time Wen Shen Hua Shi Decoction group fed the Wenshen Huashi Decoction daily. Rats were killed after two weeks, observed the formation of stone on the kidney profile, and then tested the relative expression amount of TH-protein in renal tissue which used the immunohistochemistry method. Results: Kidney stone group were the most severity in stone formation, and there were a significant difference than the Wenshen Huashi Decoction group. TH-protein were strongest expressed in contral group,and then Wen shen Huashi Decoction group and kidney stone group, significant difference in TH-protein expression among three groups. Conclusion: TH-protein can inhibit the formation of kidney stones, Wenshen Huashi Decoction can restore the TH-protein expression in rats kidney tissue, thus speculated that this may be the important role in the mechanism of prevention and cure the recurrence of kidney stones for Wenshen Huashi Decoction.

Key words:kidney stone; TH-protein; Wen Shen Hua Shi Decoction

收稿日期：(2014-11-13)编辑：曾文雪

中图分类号：R692.4

文献标识码：A

通信作者:★杨柳陈宝国*陈宝国(1962—)，男，教授，硕士生导师。研究方向：中医临床基础。邱丽瑛叶菁刘翠芳(江西中医药大学附属医院南昌 330006)