王慧娟 冯社军 武艳强 李军涛

(邯郸市中心医院，河北 邯郸 056001)

大黄素通过抑制p38 MAPK活化下调H2O2诱导PC12细胞COX-2表达的实验研究*

王慧娟 冯社军 武艳强 李军涛

(邯郸市中心医院，河北 邯郸 056001)

目的 探讨大黄素能否通过抑制p38 MAPK活化下调H2O2诱导的PC12细胞COX-2表达。方法 将神经元PC12细胞分为3组：对照组(Control组)、大黄素+H2O2组 (Emodin+H2O2组)和H2O2组。在300μM的H2O2干预4小时后使用RT-PCR法和western blot法对各组PC 12细胞COX-2 mRNA和蛋白的表达水平进行检测；并使用western blot法对PC12细胞p38 MAPK磷酸化水平(Phospho-p38 MAPK/total p38 MAPK比值)进行测量。结果 与对照组相比较，在300μM的H2O2干预4小时后PC12细胞COX-2 mRNA和蛋白的表达水平以及p38 MAPK磷酸化水平均明显升高，差异均有统计学意义(P均<0.05)；但H2O2组较Emodin+H2O2组COX-2 mRNA和蛋白的表达的升高以及p38 MAPK磷酸化水平的增加更加显著，差异均有统计学意义(P均<0.05)。结论 大黄素可以有效抑制H2O2诱导的PC12细胞COX-2表达，并与下调p38 MAPK活化水平密切相关。

大黄素； PC12细胞； 过氧化氢； 环氧化酶-2； p38 MAPK

神经元保护即减轻神经元损伤和挽救受损的神经元是脑卒中(stroke)治疗的关键和重点[1-4]。脑卒中时神经组织血流灌注障碍组织缺血缺氧直接和间接导致的严重氧化应激(oxidative stress)和炎症反应(inflammation)是造成神经元损伤和死亡的重要原因[1-4]。研究证实减轻氧化应激和炎症反应可有效减少神经元的死亡，并对脑卒中患者预后有重要价值[5-8]。大黄素(emodin)是中草药大黄(rhubarb)最主要的药理成分之一。目前研究发现大黄素对多种致炎因子诱导的炎症反应有显著的抑制作用，并认为该作用与抑制p38 MAPK的磷酸化密切相关[9, 10]。本研究的目的是探讨大黄素能否通过抑制p38 MAPK活化下调H2O2诱导的PC12细胞COX-2的表达。

1 材料和方法

1.1 主要试剂和材料 大鼠嗜铬瘤PC12细胞株从中国科学院上海细胞库购买；大黄素(纯度>98%)购买于西安崇信天然添加剂有限公司；总RNA抽提试剂盒购自北京百泰克生物技术有限公司；第一链cDNA合成试剂盒和PCR试剂盒购自日本Takara公司；兔抗鼠COX-2抗体、兔抗鼠phospho-p38 MAPK抗体、兔抗鼠p38 MAPK和兔抗鼠β-actin抗体购于美国Santa Cruz公司。DMEM培养基(美国Gibco公司)，小牛血清(杭州四季清)，甲醇(色谱纯)，乙腈(色谱纯，美国Tedia公司)，DMSO (二甲基亚砜，国药集团化学试剂有限公司)。其余试剂均为分析纯。

1.2 细胞培养 PC12细胞常规接种在含10%胎牛血清，100 g/L青霉素、100 g/L链霉素的RPMI 1640培养液中，置于37℃，5 % CO2，孵箱内培养。每72h换液、传代1次，取对数生长期细胞用于实验。PC12细胞分为对照组(Control组)、大黄素+H2O2组(Emodin+H2O2组)和H2O2组，共3组。其中对照组细胞加入PBS；H2O2组和大黄素+H2O2组加入H2O2(300μM)；大黄素+H2O2组加入50mM的大黄素进行干预。

1.3 细胞COX-2 mRNA表达检测 干预4h后，按照RT-PCR试剂盒说明书提取细胞总RNA。引物：COX-2正义5′- TTCCAACCCATGTCAAAACCG-3′，反义5′-GTCAACACGTATCTCATGGAT-3′和β-actin正义：5′- ACCCCGTGCTGCTGACCGAG-3′，反义：5′- GCCGCTGGGGAAGATGTGCT-3′。按照试剂盒说明书介绍进行反转录和扩增实验。应用凝胶成像系统(Bio-rad)摄影，Quantity One软件对目的条带进行扫描分析。用与β-actin PCR产物条带灰度比值作为COX-2 mRNA的相对表达量。

1.4 Western blot法检测细胞中COX-2、phospho-p38 MAPK和total p38 MAPK蛋白表达 按照试剂盒操作要求，首先提取细胞总蛋白，并进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，然后转移至硝酸纤维素滤膜上，用脱脂奶粉封闭1h，分别加入兔抗鼠COX-2抗体 (1∶1000)、兔抗鼠phospho-p38 MAPK抗体(1∶900)、兔抗鼠p38 MAPK抗体(1∶900)和兔抗鼠β-actin 抗体(1∶1500)，4℃孵育过夜，洗膜后加入相应的辣根过氧化物酶标记的二抗(1∶2 000)，用ECL进行显色，用凝胶成像分析系统进行扫描。使用COX-2/β-actin和Phospho-p38 MAPK/total p38 MAPK显影强度比值进行蛋白表达量分析。

1.5 统计学方法 计量资料以均数±标准差表示。采用SPSS 17.0进行单因素方差分析，两样本均数多重比较采用LSD法。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 COX-2 mRNA和蛋白的表达 在干预4h后，对PC12细胞COX-2 mRNA和蛋白的表达水平使用RT-PCR法和western blot法进行分析。发现与对照组相比较，PC12细胞在H2O2刺激后COX-2 mRNA和蛋白的表达水平明显增加，差异均有统计学意义(P均<0.05)。但H2O2组较大黄素+H2O2组COX-2 mRNA和蛋白的表达增加更加明显，差异均有统计学意义(P均<005)，见图1和表1。

图1 PC12细胞COX-2表达的RT-PCR和western blot结果

Figure 1 The RT-PCR and western blot results of COX-2 in PC12 cells

Table1 The mRNA and protein expression of COX-2, and the activation of p38 MAPK in PC12 cells

组别COX-2mRNACOX-2蛋白Phospho-p38MAPK/totalp38MAPKControl组0.24±0.050.19±0.040.16±0.05Emodin+H2O2组0.67±0.18①②0.71±0.13①②0.42±0.09①②H2O2组0.93±0.07①0.95±0.08①0.91±0.06①

注：①与Control组相比较P<0.05；②与H2O2组相比较P<0.05。

2.2 p38 MAPK的活化水平 在H2O2干预4h后，使用western blot法对PC12细胞p38 MAPK活化水平即p38 MAPK磷酸化水平(Phospho-p38 MAPK / total p38 MAPK比值)检测。我们发现与Control组相比较，PC12细胞在H2O2干预后phospho-p38 MAPK/total p38 MAPK比值明显升高，差异均有统计学意义(P<0.05)。但H2O2组较Emodin+ H2O2组phospho-p38 MAPK/total p38 MAPK比值升高更加显著，差异均有统计学意义(P<0.05)，见图2和表1。

图2 PC12细胞p38 MAPK活化的western blot结果

Figure 2 The western blot results of the activation of p38 MAPK in PC12 cells

3 讨论

脑卒中(stroke)是一种致死致残率极高的严重疾病，随着社会老龄化现象的逐渐加剧，脑卒中的发病率呈明显的上升趋势。脑卒中一般可分为由血栓栓塞和动脉粥样硬化等导致的缺血性脑卒中(ischemic stroke)以及如严重高血压和血管发育畸形等所致脑血管破裂引起的出血性脑卒中(hemorrhagic stroke)两大类[3, 4, 11]。但二者均有相似的病理生理特点和临床特征。大量基础和临床研究均发现炎症反应(inflammation)和氧化应激(oxidative stress)与脑卒中导致的神经元减少(包括坏死、凋亡和自噬等)密切相关，减轻和抑制炎症反应及氧化应激对神经元有保护作用[13, 14]。

大黄作为中国常用中草药，具有广泛的药用价值，中医认为大黄具有"攻下积滞、清热解毒、泻火凉血及活血化瘀"等作用。目前临床多用于急性胰腺炎、肾小球肾炎、急性肾功能衰竭和急性胆囊炎等炎症相关性疾病的治疗。大黄素(emodin)是中草药大黄(rhubarb)最主要的药理成分之一。目前研究认为大黄素具有较为广泛的抑制炎症反应的药理作用[9, 10]。秦建华等人发现大黄素可以有效抑制致炎因子IL-1β诱导的大鼠肾小管上皮细胞株(NRK52E)转分化效应，并具有潜在的抑制肾脏炎症反应作用[9]。王青等人的研究表明在人结肠癌HT-29细胞中大黄素对内毒素(LPS)诱导的IL-8表达有明显的抑制作用[10]。环氧酶(cyclo-oxygen-ase, COX) 是前列腺素(PGs)合成初始步骤中的关键性限速酶，包括COX-1 和COX-2两种同工酶[14]。COX-1在生理状态下具有有保护胃肠黏膜、激活血小板及维持肾、和心脑血流灌注功能等的作用，并参与巨噬细胞的分化。COX-2 具有环氧化酶和过氧化氢酶活性，研究发现炎症反应和氧化应激等病理状态时COX-2表达明显增加，使下游的PGE2、PGH2和VEGF等炎症介质表达增加，同时间接诱导氧自由基、脂氧化产物和活性氧等氧化应激相关物质的生成促进细胞损伤[15, 16]。同时研究还发现COX-2与细胞凋亡关系密切[15, 16]。研究证实COX-2在脑卒中相关的炎症反应和氧化应激反应中扮演着重要的角色，下调COX-2的表达可有效抑制神经元的损伤和死亡[15, 16]。在本实验中我们使用H2O2对神经元PC12细胞进行干预。在干预4小时后，PC12细胞COX-2 mRNA和蛋白的表达明显增加，但大黄素干预的PC12细胞较未干预细胞COX-2表达水平降低，差异均有统计学意义(P均<0.05)。该结果表明在PC12细胞中大黄素对H2O2诱导的COX-2表达有显著抑制作用。

目前研究发现大黄素的抗炎症和抗氧化应激作用与抑制p38 MAPK的磷酸化密切相关[17, 18]。p38 MAPK是丝裂原活化蛋白激酶信号转导通路中的关键蛋白，对包括COX-2、TNF-α、ICMA-1和IL-8等炎症蛋白和介质的表达具有转录水平的调控作用[19, 20]。我们对PC12细胞p38 MAPK活化水平分析发现，在H2O2干预4小时后，PC12细胞phospho-p38 MAPK/total p38 MAPK比值明显增加，但大黄素干预组细胞p38 MAPK磷酸化水平较未干预组细胞更低，差异有统计学意义(P<0.05)。该结果表明在PC12细胞中大黄素可以通过抑制H2O2诱导的p38 MAPK磷酸化减轻炎症反应和氧化应激。

4 结论

本文研究结果提示，在PC12细胞中大黄素可能通过抑制p38 MAPK的磷酸化下调H2O2诱导的COX-2合成。该基础研究为大黄素应用于脑卒中相关的炎症反应和氧化应激治疗以及神经元保护奠定了一定理论基础，但仍需进一步的实验研究证实其在临床中的价值和意义。

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Emodin Down-regulates H2O2-induced COX-2 expression by inactivation of p38 MAPK in PC12 cells

WANG hui-juan，FENG She-jun，WU yan-qiang，etal

(HandanCentralHospital,Handan056001,Hebei,China)

Objective To explore whether emodin would inhibit H2O2-induced COX-2 expression via inactivation of p38 MAPK in neuron PC12 cells. Methods PC12 cells were divided into 3 control group, emodin+H2O2group and H2O2group. After 4 hours H2O2intervention, RT-PCR was used to measure the mRNA expression of COX-2. Meanwhile, western blot was performed to detect the protein expression of COX-2 and the ratio of phospho-p38 MAPK/total p38 MAPK, which was used to analyze the activation of p38 MAPK. Results After 4 hours H2O2intervention, the mRNA and protein expression of COX-2 was noticeably up-regulated, and the phosphorylation level of p38 MAPK was sharply raised. Moreover, H2O2-induced the up-regulation of COX-2 and the raised level of phospho-p38 MAPK were both ameliorated by emodin in PC12 cells. Conclusion Emodin down-regulates the expression of COX-2 possibly via inactivation of p38 MAPK in PC12 cells.

Emodin; PC12 cells; H2O2; COX-2; p38 MAPK

河北省卫生厅重点科技研究计划(20130359)

李军涛,主任医师。E-mail：lijuntao2014@163.com

R 915

A

10.3969/j.issn.1672-3511.2015.02.005

2014-07-10； 编辑： 张文秀)