郑霁 方强 陈志文 陈志朋 何鹏 邓国贤 代林勇 潘进洪

(第三军医大学西南医院·全军泌尿外科研究所, 重庆 400038)

IP3R介导的钙释放在DI发生中的作用研究*

郑霁 方强 陈志文 陈志朋 何鹏 邓国贤 代林勇 潘进洪

(第三军医大学西南医院·全军泌尿外科研究所, 重庆 400038)

目的 探讨IP3R的功能改变是否参与了逼尿肌不稳定(DI)的发生。方法 对比分析DI和对照组大鼠膀胱平滑肌IP3R mRNA和蛋白表达的变化，观察IP3R阻断剂Heparin对DI和对照组膀胱平滑肌条收缩幅度和频率的影响。 结果 DI逼尿肌细胞IP3R mRNA和蛋白表达较对照组显著增加。IP3R阻断剂Heparin能显著抑制DI、正常组大鼠逼尿肌肌条自发收缩频率及收缩幅度，且Heparin对DI逼尿肌条的影响效应要显著高于正常组。结论 IP3R功能在DI逼尿肌组织兴奋、收缩发生中明显上调，这种上调在DI的发生中起着重要作用。

IP3R； 钙离子通道； 逼尿肌不稳定； 尿动力学

正常成年人只在排尿期出现逼尿肌收缩而在储尿期不会出现逼尿肌收缩,如果在储尿期出现具有一定强度(≥15 cm H2O)、人为意识不能抑制的逼尿肌收缩即称为逼尿肌不稳定(detrusor instability,DI)。DI发病率高，临床治疗效果欠佳，已经成为一个较为严重的公共卫生问题[1]。钙离子及其相关钙离子通道是包括逼尿肌细胞在内的平滑肌收缩和兴奋性调控的重要传导介质和通路[2]。IP3受体通道(inositol 1,4,5-trisphosphate receptor，IP3R)可参与释放肌浆网(SR, sarcoplasmic reticulum )钙库钙，是调控平滑肌细胞收缩的关键通道之一。本研究旨在探讨IP3R的功能改变是否参与了DI的发生。

1 材料与方法

1.1 实验动物 3～4月龄雌性Wistar大鼠30只, 体质量180～200g, 购自第三军医大学实验动物中心。

1.2 制作DI模型 1%苯巴比妥( 40mg/kg) 腹腔注射麻醉, 下腹部正中切口,直径为1mm的聚乙烯探子插入尿道, 近端尿道稍作分离, 2-0丝线结扎尿道, 松紧以牵拉探子周围组织可随之移动, 而探子又可轻易拔出为度, 拔出探子, 关闭切口。对照组除不予结扎尿道外其余操作均同上。

1.3 尿动力学检查 所有动物均行膀胱压力容积测定( 膀胱灌注速率为0.2ml/min), 记录膀胱压力波形、大小变化, 根据尿动力学检查结果将大鼠分为DI组和对照组。

1.4 离体逼尿肌条试验 猛击大鼠头部致昏, 剪开下腹部, 全切膀胱, 称质量。即刻置入盛有4℃Krebs营养液的平皿中, 每个膀胱制作2～3 根肌条。Krebs 液中通95% O2、5%CO2, 肌条静置30 min 后进行以下试验, 记录肌条的收缩力和收缩频率。每步试验后更换肌条。

1.5 IP3R mRNA的检测 IP3R1引物序列：上游引物5′-ACCAGTTGGCTCGGCATA-3′，下游引物5′-TGGGCACAGGGAAGACAA-3′。IP3R2引物序列：上游引物5′-ATGT GGCTCAAATGATTGTGGA-3′下游引物5′-ATGTGGCT CAAATGATTGTGGA- 3′。GADPH引物序列:上游引物5′-CATC AC TGCCACCCAGAAGAC-3′下游引物5′-ACTCCT T GGAGGCC ATGT AGAC-3′。

将标本加入反转录反应液中， 42℃反转录50 min，95℃ 5 min 灭活反转录酶。在将反转录产品加入PCR 反应液中，PCR 热循环参数: 96℃ 4 min，然后三步反应: 94℃ 30s， 58℃ 30 s， 72℃ 30 s，进行40 个循环，于每个循环的第3 步即72℃ 30 s 收集荧光信号。扩增完毕后，进入结果分析界面，以GAPDH 为内参照基因，与对照组相比，得到目的基因表达的相对定量值( RQ 值)，将RQ值用于统计分析。

1.6 IP3R蛋白的Western blot检测 将离心管中的细胞加入RIPA 裂解液匀浆。冰浴反应30 min; 4℃，8 000 r /min 离心10 min，取上清( 即蛋白提取液) 加入PMSF 调至终浓度为1%，-20℃ 保存。取少量蛋白提取液，以牛血清白蛋白为标准物，采用改良酚试剂法，检测其中总蛋白含量。并转移至PVDF 膜上，应用5% 脱脂奶粉封闭，随后置于IP3RⅠ或IP3R II一抗中。室温洗膜，共3 次。之后置入二抗溶液中，抗体结合区带用化学发光法检测定量值( IOD 值)，将IOD 值用于统计分析。

2 结果

发现DI逼尿肌细胞IP3R mRNA(图1)和蛋白(图2)表达较对照组显著增加。发现IP3R 阻断剂 Heparin(图3) 能显著抑制DI、正常组大鼠逼尿肌肌条自发收缩频率及收缩幅度，且Heparin对DI逼尿肌条的影响效应要显著高于正常组(图3)，提示IP3R功能在DI逼尿肌组织兴奋、收缩发生中明显上调。

图1 DI后逼尿肌细胞IP3R mRNA表达显著增加

Figure 1 The increased IP3R mRNA

图2 DI后逼尿肌细胞IP3R 蛋白表达显著增加

Figure 2 The increased IP3R protein

3 讨论

钙离子及其相关钙离子通道是包括逼尿肌细胞在内的平滑肌收缩和兴奋性调控的重要传导介质和通路[2]。平滑肌细胞收缩依赖于细胞内钙离子浓度瞬时增加，平滑肌细胞内的钙通常有两个来源，一是动作电位期间经细胞膜电压依赖性钙通道(VDCC)或其它非选择性离子通道内流入胞的细胞外钙，另一个来源是由肌浆网(SR, sarcoplasmic reticulum )钙库内通过Ryanodine受体通道(RyR, Ryanodine receptor)和IP3受体通道(IP3R, inositol 1,4,5-trisphos-

图3 IP3 blocker(Heparin)可明显抑制DI逼尿肌组织自发性收缩频率和幅度。DI逼尿肌受抑制程度显著高于对照组逼尿肌。

Figure 3 IP3 blocker inhibited fasciculation of detrusor muscle

phate receptor )释放的细胞内钙[3]。

平滑肌细胞兴奋收缩时，SR中钙通过IP3R通道和/或RyR通道释放可将细胞外钙内流的信号显著扩大，迅速引起细胞内更大峰度的钙离子浓度升高[4]，从而引起细胞收缩。而SR中的钙离子释放也可通过作用胞膜上的钙离子激活钾/氯离子通道(Ca2+activated K+/Cl-Channel, Kca/Kcl)[5]，影响细胞膜电位和细胞外钙通过VDCC内流入胞。此外细胞膜电位和细胞内的钙浓度也可通过影响细胞内源性IP3的生成，从而调控SR中钙离子释放[6]。这表明平滑肌细胞兴奋、收缩时，通过钙离子及胞膜、肌浆网上相关钙通道，细胞外钙离子内流入胞与肌浆网(SR)中钙离子释放入胞浆可相互关联和影响，从而调控平滑肌的收缩和兴奋性。

有研究证实，RyR通道和IP3R通道介导的SR中钙释放均参与逼尿肌自发性收缩的发生[7]。我们既往研究证实,RyR通道功能下调，从而导致介导的SR中钙释下降参与了DI的发生[8]。但IP3R通道功能的变化是否参与DI的发生，目前国内外尚未见报道。本研究发现IP3R 阻断剂 Heparin能显著抑制DI、正常组大鼠逼尿肌肌条自发收缩频率及收缩幅度，且Heparin对DI逼尿肌条的影响效应要显著高于正常组，提示IP3R功能在DI逼尿肌组织兴奋、收缩发生中明显上调。IP3R功能上调在DI的发生中起重要作用。

4 结论

本研究结果显示，IP3R通道和/或RyR通道均可被钙离子所激活，IP3R通道和RyR通道除了单独发挥介导SR中的钙释放外，两者之间很可能具有相互激活、相互促进的作用(IP3R-RyR Cross talk)[9]。鉴于平滑肌细胞中存在IP3R-RyR cross talk介导的肌浆网中钙释放， 且该Cross talk效应介导的钙释放很可能对膀胱平滑肌细胞收缩和兴奋性具有重要调控作用，我们推测，DI逼尿肌组织中，除单纯IP3R介导的SR中钙释放外，IP3R-RyR交叉对话介导的钙释放功能上调也可能是DI逼尿肌细胞兴奋、收缩异常增强发生的关键环节，值得进一步深入研究。

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Role of IP3R mediated Ca2+release in detrusor instability

ZHENG Ji, FANG Qiang, CHEN Zhi-peng,etal

(InstituteofUrinarySurgery,SouthwestHospital,TheThirdMilitaryMedicalUniversity,Chongqing400038)

Objective To investigate the role of IP3R mediated Ca2+release in detrusor instability. Methods The expression of IP3R mRNA and protein were tested from rat detrusor of DI and control group group. The effect of IP3R blocker heparin on detrusor strips were then recorded for further analysis. Results Compared with control group, the expression of IP3R mRNA and protein were significantly increased in detrusor strips from DI group. Heparin can significantly inhibited the frequency and amplitude of spontaneous contractile activity in both the DI and control strips. The inhibit effect by heparin was more obvious in DI group. Conclusion The elevated expression and function of IP3R contributed to detrusor instability.

IP3R; Ca2+channel; Detrusor instability; Urodynamic

国家自然科学基金青年基金(NSFC81100539)

陈志文，Tel:13983602535

R 446.8

A

10.3969/j.issn.1672-3511.2015.02.003

2014-11-03； 编辑： 张文秀)