韩婷姣，许建英

吸烟和不同饲养方式对大鼠动脉粥样硬化的影响

韩婷姣1，许建英2

摘要：目的探讨吸烟和不同饲养方式对大鼠动脉粥样硬化形成的影响及其可能的机制。方法将48只6周龄清洁级雄性SD大鼠按吸烟与否和不同饲养方式随机分为吸烟正常、高脂和饥饿组及非吸烟正常、高脂和饥饿组，分别给予香烟烟雾或空气暴露和正常、高脂及饥饿饲养。24周后检测大鼠Lee’s指数，观察主动脉粥样硬化病理学改变，免疫组化法检测主动脉血管内皮生长因子(VEGF)，酶联免疫吸附法检测血清肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素-6(IL-6)和脂联素(APN)水平。结果吸烟影响Lee’s指数，主动脉VEGF，血清TNF-α、IL-6和APN水平(F值分别为27.710，55.370，47.310，37.405，7.064；P<0.05)。吸烟使Lee’s指数降低，使主动脉VEGF，血清TNF-α和IL-6水平增高。不同饲养方式影响Lee’s指数，主动脉VEGF，血清TNF-α、IL-6和APN水平(F值分别为95.290，3.915，7.276，9.791，48.877；P<0.05)。吸烟组和非吸烟组内均高脂组Lee’s指数高于正常组和饥饿组，正常组高于饥饿组。吸烟组内：高脂组主动脉VEGF水平高于正常组和饥饿组；高脂组和饥饿组血清TNF-α和IL-6水平均高于正常组；高脂组血清APN水平低于正常组和饥饿组，正常组低于饥饿组，差异均有统计学意义(P<0.05)。对于血清APN，吸烟和不同饲养方式有交互作用(F=10.675，P<0.05)。非高脂饲养(正常组和饥饿组)大鼠，吸烟使血清APN水平升高；高脂组大鼠，吸烟使血清APN水平降低。吸烟组主动脉VEGF与血清TNF-α和IL-6水平呈正相关(r值分别为0.471，0.448；P<0.05)。镜下观察主动脉，发现非吸烟组无动脉粥样硬化发生，吸烟组可见早期动脉粥样硬化改变。结论吸烟和不同饲养方式均可影响动脉粥样硬化形成，吸烟且高脂饲养状态动脉粥样硬化最显著，系统性炎症反应可能参与其中。

关键词：动脉粥样硬化；饲养方式；吸烟

动脉粥样硬化是多种心血管系统疾病的基本病理改变，且是一种复杂的炎性病变疾病，有多种因素共同参与[1]，包括遗传、年龄、性别等不可控因素和饮食习惯、吸烟、肥胖、高脂血症、高血压等可控因素，而其确切发病机制尚不明确，可能有血管内皮细胞功能紊乱、炎症反应、氧化应激、血脂代谢异常等机制参与其中。而当前随着社会经济条件的改善，人们饮食结构发生改变，肥胖、吸烟人群增多，动脉粥样硬化的患病率也逐年增高。因此本实验拟通过观察正常、高脂和饥饿饲养的吸烟及非吸烟大鼠动脉粥样硬化程度及血清肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素-6(IL-6)和脂联素(APN)的水平，探讨不同饲养方式和吸烟对动脉粥样硬化的影响及其可能的机制。

1材料与方法

1.1动物分组和模型建立清洁级健康雄性SD大鼠48只，体质量200 g±20 g，由山西医科大学动物实验中心提供；按吸烟与否和不同饲养方式随机均分为吸烟正常组、吸烟高脂组、吸烟饥饿组、非吸烟正常组、非吸烟高脂组和非吸烟饥饿组。参照文献[2]自制大鼠实验性吸烟装置，卷烟为市场销售的红旗渠牌卷烟，焦油含量每支11 mg，烟碱含量每支0.9 mg。吸烟组大鼠于装置内给予烟雾暴露，每周熏烟6 d，每天上、下午各1次，每次15支，每支香烟点燃15 min后换烟，每次1.5 h。非吸烟组同时放至相同装置内给予空气暴露。正常组给予脂肪能量百分比为10%的D12450B普通饲料(100 g体重10 g/d)；高脂组给予脂肪能量百分比为45%的D12451高脂饲料(100 g体重10 g/d)；饥饿组给予脂肪能量百分比为10%的D12450B普通饲料(100 g体重6 g/d)，饲料均购自广东省医学实验动物中心。余饲养条件相同。每周记录大鼠体重(g)及体长(cm)，以监测大鼠生长状况。共建造模型24周。

作者单位：1.山西医科大学第一临床医学院(太原 030001)；2.山西医科大学附属山西大医院

1.2Lee’s指数测定24周后腹腔注射麻醉大鼠，测量其体重(g)及体长(cm)(大鼠鼻尖至肛门的距离)，计算Lee’s指数=(体重×1 000)1/3/体长。

1.3血清肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素-6(IL-6)和脂联素(APN)检测腹主动脉采血，离心，分装血清，-80 ℃冻存。用酶联免疫吸附(ELISA)法测定血清TNF-α、IL-6和APN水平(APN试剂盒购自美国R&D生物科技有限公司，TNF-α和IL-6试剂盒购自上海蓝基生物科技有限公司)。

1.4主动脉病理学分析及VEGF测定取主动脉根至胸主动脉血管，同上述步骤制成HE染色切片。观察主动脉病理学改变。采用改良链酶亲和素-生物素-过氧化物霉复合物(SABC)法检测主动脉VEGF水平。试剂，一抗：VEGF兔抗大鼠多克隆抗体(1∶150稀释)；二抗：SABC免疫组化染色试剂盒DAB显色试剂盒均购自武汉博士德生物工程有限公司。基本步骤：上述蜡块同步制成带电荷切片，常规脱蜡至水，过氧化氢10 min，抗原修复，封闭，先后加一抗、二抗及SABC、DAB显色剂。阳性结果为细胞质棕黄色。每只大鼠取1个切片，每张切片×400下随机选取5个视野进行图像采集，用Image-Pro Plus 6.0软件处理分析，计算平均积分光密度(积分光密度/面积)。

2结果

2.1Lee’s指数析因分析及各组比较吸烟和不同饲养方式均影响Lee’s指数水平(F值分别为27.710，95.290；P<0.05)，两者间无交互作用(F=0.455，P>0.05)。吸烟组与非吸烟组比较，Lee’s指数降低。吸烟组和非吸烟组内均高脂组Lee’s指数高于正常组和饥饿组，正常组高于饥饿组，差异均有统计学意义(P<0.05)。详见表1、表2。

表1　各指标析因分析结果

表2　6组各指标的比较(±s)

2.2主动脉病理学改变和VEGF水平析因分析镜下发现非吸烟组无动脉粥样硬化发生，内皮细胞结构完整，无增生，层次较为清楚；吸烟组可见早期动脉粥样硬化改变，内皮细胞水肿，平滑肌细胞迁移和增生。吸烟和不同饲养方式均影响主动脉VEGF水平(F值分别为55.370，3.951；P<0.05)，两者间无交互作用(F=1.261，P>0.05)。吸烟组与非吸烟组比较，主动脉VEGF水平增高。吸烟组内高脂组主动脉VEGF水平高于正常组和饥饿组，差异均有统计学意义(P>0.05)。吸烟组内正常组和饥饿组主动脉VEGF表达水平、非吸烟组内3组主动脉VEGF表达水平比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。详见表1、表2。

2.3血清TNF-α和IL-6水平析因分析吸烟和不同饲养方式均影响血清TNF-α和IL-6水平(F值分别为47.310，7.276，37.405，9.791，P<0.05)，两者间均无交互作用(F值分别为0.413，0.499；P>0.05)。吸烟组与非吸烟组比较，血清TNF-α和IL-6水平增高。吸烟组内高脂组和饥饿组血清TNF-α和IL-6水平均高于正常组，差异均有统计学意义(P<0.05)，高脂组与饥饿组差异无统计学意义(P>0.05)。详见表1、表2。

2.4血清APN水平析因分析吸烟和不同饲养方式均影响血清APN水平(F值分别为7.064，48.877；P<0.05)，两者间有交互作用(F=10.675，P<0.05)。非高脂饲养(正常组和饥饿组)大鼠吸烟使血清APN水平升高，高脂组大鼠吸烟使血清APN水平降低。吸烟组内高脂组血清APN水平低于正常组和饥饿组，正常组低于饥饿组，差异均有统计学意义(P<0.05)。详见表1、表2。

2.5吸烟组各因子相关性分析吸烟组主动脉VEGF与血清TNF-α和IL-6水平呈正相关(r值分别为0.471，0.448；P<0.05)。

3讨论

本研究通过分析各组大鼠Lee’s指数水平，发现不同饲养方式影响Lee’s指数，吸烟及非吸烟大鼠均为高脂饲养状态Lee’s指数最高和饥饿饲养状态Lee’s指数最低。并观察了各组大鼠主动脉病理学改变，发现吸烟大鼠主动脉有早期动脉粥样硬化改变。Celletti等[3]研究表明VEGF可促进动脉粥样硬化进展的速度和程度，本研究发现吸烟和不同饲养方式均影响大鼠主动脉VEGF，吸烟且高脂饲养大鼠动脉粥样硬化VEGF水平最高，故吸烟和高脂饲养均可促进动脉粥样硬化的发生发展。这证实了目前的临床研究结论，吸烟[4]和肥胖均为冠心病的危险因素。目前关于吸烟和肥胖促进动脉粥样硬化发生发展的作用机制尚不确切。现认为动脉粥样硬化是一种炎性病变疾病，本研究推测以上两因素可能通过炎症反应参与其中，故进一步观测了各组大鼠血清TNF-α、IL-6、APN的水平。

本研究发现吸烟使大鼠血清TNF-α和IL-6的水平增高，且吸烟大鼠TNF-α、IL-6与动脉粥样硬化程度呈正相关。TNF-α[5]和IL-6可通过促进黏附分子分泌、介导内皮细胞损伤、促进血栓形成等途径促进动脉粥样硬化的发生发展。故表明吸烟可能通过系统性炎症反应促进动脉粥样硬化发生发展。

有研究证实APN具有抗炎和抗动脉粥样硬化作用，低APN血症是冠心病的独立危险因素[6]。本研究发现吸烟和不同饲养方式对血清APN影响存在交互作用。吸烟且高脂饲养大鼠血清APN水平较非吸烟且高脂饲养大鼠低，血清TNF-α和IL-6水平较吸烟且正常饲养大鼠高。APN可通过抑制成熟巨噬细胞功能、粒-单系祖细胞的生长、TNF-α在血浆中的浓度等多种途径发挥抗炎作用，通过保护血管内皮细胞[7]、抑制巨噬细胞对胆固醇酯的摄取[8]、抑制平滑肌细胞增生迁移[9-10]等多种机制发挥抗动脉粥样硬化作用。故推测吸烟且高脂饲养大鼠可能由于血清APN水平的降低，抗炎、抗动脉粥样硬化作用减弱，且系统炎症反应增强，导致动脉粥样硬化最为显著。本研究还发现吸烟且饥饿饲养大鼠血清APN、TNF-α和IL-6水平均比吸烟且正常饲养大鼠高，两组大鼠主动脉VEGF虽差异无统计学意义，但吸烟且饥饿饲养大鼠有增高趋势。肿瘤疾病厌食恶病质和维持性血液透析消瘦病人炎症因子显著升高[11]，故推测上述结果原因为吸烟和饥饿状态均为系统性炎症反应增高，而增高的APN尚不足以对抗所致。但尚需进一步的研究予以证实。

综上所述，本研究结果提示吸烟和不同饲养方式均可影响动脉粥样硬化形成，吸烟且高脂饲养状态动脉粥样硬化最显著，炎症反应可能参与其中。

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(本文编辑郭怀印)

(收稿日期：2015-05-11)

通讯作者：许建英，E-mail：xujyty@126.com

中图分类号：R543.5R256.2

文献标识码：A

doi：10．3969/j．issn．1672-1349．2015．18．011

文章编号：1672-1349(2015)18-2064-03