王洪家

(天津市北辰区药品检验所，天津 300400)



双波长HPLC法同时测定壮骨止痛颗粒中淫羊藿苷、延胡索乙素和蛇床子素含量

王洪家

(天津市北辰区药品检验所，天津 300400)

目的：建立测定壮骨止痛颗粒中淫羊藿苷、延胡索乙素和蛇床子素含量方法。方法：采用高效液相色谱法，以乙腈为流动相A，水为流动相B，梯度洗脱；检测波长为280 nm(淫羊藿苷、延胡索乙素)，322 nm(蛇床子素)，柱温：40 ℃；流速：1.0 ml/min；进样量：10 μl。结果：淫羊藿苷在8.07～53.8 μg/ml浓度范围内线性良好(r=0.999 9,n=5)，延胡索乙素在3.08～20.5 μg/ml浓度范围内线性良好(r=0.999 9,n=5)，蛇床子素在6.02～40.1 μg/ml浓度范围内线性良好(r=0.999 9,n=5)，平均回收率分别为99.7%、 99.7和99.9%%，RSD分别为1.06%、0.86%和0.81%。结论：本法操作简便，重现性好，可有效控制该制剂质量。

高效液相色谱法，壮骨止痛颗粒，淫羊藿苷，延胡索乙素，蛇床子素

壮骨止痛颗粒是天津市天津医院的制剂品种，该制剂由淫羊藿、蛇床子和延胡索组成，具有补肾壮骨、活血止痛的功效，临床上用于治疗筋骨痿软、风湿痹痛、绝经后骨质疏松症、老年性骨质疏松症等。该制剂临床上疗效确切，现有质量标准含量测定只检测淫羊藿苷，为了更有效地控制该制剂的质量，现在原有质量标准基础上，采用双波长HPLC法同时测定制剂中淫羊藿苷、蛇床子素和延胡索乙素三组分的含量，该方法操作简便，重现性好，可以有效控制该制剂的质量。

1 仪器与试药

1.1 仪器 日本SHIMADZU LC-2010AHT高效液相色谱仪，LC solution工作站。色谱柱： DiamonsilTMC18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；赛多利斯BP211D电子天平；岛津UV2450型紫外-可见分光光度计。

1.2 试药 对照品：淫羊藿苷(中国药品生物制品检定所，批号110737-200415)、蛇床子素(中国药品生物制品检定所，批号110822-200305)、延胡索乙素(中国药品生物制品检定所，批号110726-201112)。样品：天津市天津医院(批号130117、130415、130420，规格：10 g/袋)。甲醇、乙醇、乙腈均为色谱纯；水为纯化水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 流动相：以乙腈为流动相A，以水为流动相B，按表1中的规定进行梯度洗脱；检测波长为280 nm(淫羊藿苷、延胡索乙素)和322 nm(蛇床子素)，柱温为40 ℃，流速为1.0 ml/min，进样量10 μl。理论板数按淫羊藿苷峰计算应不低于3 000[1]。

表1 梯度洗脱表

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液 分别称取淫羊藿苷对照品、蛇床子素对照品和延胡索乙素对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 ml 约含淫羊藿苷50 μg、蛇床子素40 μg和延胡索乙素20 μg的混合溶液，作为对照品储备液；取对照品储备液加甲醇制成每1 ml约含淫羊藿苷25 μg、蛇床子素20 μg和延胡索乙素10 μg的对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液 取“装量差异”项下的内容物，研细，取约1 g，精密称定，精密加入稀乙醇20 ml，称定重量，超声处理1 h(功率300 W,频率40 kHz)，放冷，再称定重量，用稀乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.2.3 阴性样品溶液 按处方比例及制法制成分别不含淫羊藿、蛇床子、延胡索的阴性样品，再按“2.2.2”项下方法制得阴性样品溶液。

2.3 系统适用性试验 取对照品溶液、供试品溶液和阴性样品溶液各10 μl，按“2.1”项下色谱条件进样，结果阴性样品溶液分别在淫羊藿苷、延胡索乙素和蛇床子素相对应的保留时间处无干扰。结果见图1。

2.4 标准曲线的制备 分别精密吸取“2.2.1”项下对照品储备液3、5、10、15和20 ml,加甲醇分别稀释至20

ml，制得每1 ml含淫羊藿苷分别为8.07、13.45、26.9、40.35和53.8 μg的溶液,含延胡索乙素分别为3.08、5.12、10.25、15.38和20.5 μg的溶液，含蛇床子素分别为6.02、10.02、20.05、30.08和40.1 μg的溶液。取上述各浓度溶液10 μl，分别注入液相色谱仪，按“2.1”项下色谱条件分析，测定各自峰面积，以对照品浓度(μg/ml)为横坐标，峰面积值为纵坐标，求得淫羊藿苷回归方程：Y=14 143X+4 611.8(r=0.999 9)、延胡索乙素回归方程：Y=18 808X+385.0(r=0.999 9)、蛇床子素回归方程：Y=25 730X+2 203.4(r=0.999 9)。结果表明淫羊藿苷在8.07～53.8 μg/ml范围内线性良好，延胡索乙素在3.08～20.5 μg/ml范围内线性良好，蛇床子素在6.02～40.1 μg/ml范围内线性良好。

2.5 进样重复性试验 取“2.2.1”项下对照品溶液,按“2.1”项下色谱条件分析，连续进样6次，分别测定对照品溶液中三个对照品主峰面积，测得淫羊藿苷峰面积的RSD为0.49%，延胡索乙素峰面积的RSD为0.31%，蛇床子素峰面积的RSD为0.29%，结果符合要求。

1.淫羊藿苷 2.延胡索乙素 3.为蛇床子素

2.6 重现性试验 取同一批号(130117)样品“装量差异”项下的内容物，研细，取约1 g，精密称定，共取6份，按照“2.2.2”项下方法操作，按“2.1”项下色谱条件分析，测定每份样品中三种成分含量。结果每1 g样品中淫羊藿苷平均含量为1.026 8 mg，RSD为1.7%，延胡索乙素平均含量为0.2313 mg，RSD为1.8%，蛇床子素平均含量为0.672 8 mg，RSD为1.7%，结果均符合要求。

2.7 稳定性试验 取同一批号(130117)样品装量差异项下的内容物，研细，取约1 g，精密称定，按照“2.2.2”项下方法操作，按“2.1”项下色谱条件分析，分别在0、2、4、6、8和10 h，测定样品中淫羊藿苷、延胡索乙素和蛇床子素峰面积，测得峰面积值的RSD分别为0.66%、0.61%和0.57%，说明样品溶液在10 h内稳定，符合试验要求。

2.8 回收率试验 取已知含量的样品(批号130117)适量，研细，取约0.5 g，共9份，精密称定，分别精密加入“2.2.1”项下对照品储备液8、10和12 ml各3份，再加稀乙醇稀释至20 ml，制得供回收率用供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件分析，计算回收率，结果淫羊藿苷平均回收率为99.7%，RSD为1.06%；延胡索乙素平均回收率99.7%，RSD为0.86%；蛇床子素平均回收率99.9%，RSD为0.81%。符合试验要求。结果见表2-表4。

表2 淫羊藿苷回收率试验结果

表3 延胡索乙素回收率试验结果

表4 蛇床子素回收率试验结果

2.9 样品测定 取3个批号的样品，按照“2.2.2”项下方法操作，按“2.1”项下色谱条件测定样品中淫羊藿苷、延胡索乙素和蛇床子素含量。结果见表5。

表5 样品含量测定结果

3 讨论

3.1 流动相的选择 选择流动相时，分别比较了甲醇-水和乙腈-水不同比例的流动相系统，结果以乙腈-水进行梯度洗脱，各个组分可以与相邻杂质峰分离完全，峰形较好。

3.2 检测波长的选择 经紫外光谱扫描，可以看到淫羊藿苷在270 nm有最大吸收，延胡索乙素在280 nm有最大吸收，蛇床子素在322 nm有最大吸收，考虑到延胡索乙素含量较低，故将淫羊藿苷与延胡索乙素的检测波长定为280 nm。

3.3 提取方法和提取溶剂的考查 试验中分别采取加热回流和超声处理的提取方法，测定结果基本相同，为试验操作方便简捷，故将超声提取定为本品提取方法。试验中还分别采取甲醇、50%甲醇、乙醇和稀乙醇为提取溶剂，结果显示，提取溶剂使用单纯的甲醇或乙醇提取，含量测定结果较低；而采用加有水的甲醇和乙醇，测定结果较高，考虑到乙醇的低毒性，故本试验提取溶剂定为稀乙醇。

1 中国药典.一部.2010：130，295，306

2015-03-19

R927.2

A

1006-5687(2015)04-0017-03