洪巧瑜 张建军 王克荣 王林元 李 伟

1.北京卫生职业学院，北京 100053；2.北京中医药大学，北京 100029

双龙颗粒[1-2]系在中医药理论的指导下，在多年临床实践经验的基础上，结合现代医药研究成果，确定了双龙颗粒处方。具有疏风解表、清肺化痰、降气平咳的功能。临床用于哮喘风哮证，证见时发时止，止时又如常人，发作前鼻痒，喷嚏，咳嗽，痰粘。双龙颗粒由麻黄、地龙、防风、杏仁、甘草等中药经提取加工制成的颗粒，方中各药味所发挥的功用既相互独立又相互协作，所含成分既有水溶性部位，也有脂溶性部位，如只选定一种指标成分进行提取工艺优选，难以保证制剂整体疗效的发挥。为将各药味中主要有效部位尽可能提取充分，本研究采用醇水双提法[3-4]。

由于双龙颗粒的制备工艺研究处方药味较多，对提取工艺的优化用单一指标考察具有较大的片面性，本研究每条工艺路线都选定了多指标[5-6]来考察各提取因素，使提取工艺更具全面性和科学性。处方中部分药物麻黄、黄芪、柴胡、苦杏仁、防风、地龙、甘草主要有效成分为水溶性成分，如生物碱类[7]、苷[8]、氨基酸[9]、香豆素类[10]，故选择水作为溶剂，本研究选定对加水量、提取时间、提取次数作为考察因素，对工艺进行优选。由于处方药味较多，对提取工艺的优化用单一指标考察具有较大的片面性。所以本文选定了以浸出物的量、一种生物碱为主、一种皂苷为辅的代表性指标来考察各提取因素，使提取工艺更具全面性和科学性。本研究采用正交设计法，以提取干膏量，盐酸麻黄碱含量，苦杏仁苷含量为考察指标，对双龙颗粒水提部分的加水量、水煮时间、提取次数三因素进行优选研究。

1 材料与仪器

1.1 药品与试剂

盐酸麻黄碱对照品（中国药品生物制品检定所提供，批号为0090-9801）；苦杏仁苷对照品（中国药品生物制品检定所提供，批号为110820-200403）；药材为北京药材公司提供，其余试剂均为色谱纯。

1.2 仪器

岛津SPD-10A 色谱柱为SinoChrom-BP（4.6mm×250mm，5μm）。

表2 水煮提取工艺L9（34）正交试验表

2 水提工艺研究的方法

2.1 药材吸水量的考察

按处方量称取药材麻黄9g、地龙6g、杏仁6g等，总计51g，加水浸泡24h，测定其吸水量为2 倍，浸没药材最小加水量为8 倍，以此作为设定加水量的依据。

2.2 水提工艺的正交试验设计方案

为了提高药物的提取效率，选取对提取影响大的对工艺中加水量（A），煎煮时间（B），煎煮次数（C）三个因素进行考察，同时，每个因素取三个水平，见表1。

2.3 水提工艺的含量测定

2.3.1 色谱条件 色谱柱：Agilent Hypersil ODS2（4.6mm×200mm 5μm）色谱柱，流动相：甲醇：0.1%磷酸溶液（5︰95），流速：1.0mL/min，检测波长：207nm，柱温：室温，流速：1.0mL·min，理论板数：以盐酸麻黄碱峰计算应不低于3000，以苦杏仁苷峰计应不低于5000。

表1 水煮提取工艺正交试验因素水平表

2.3.2 对照品溶液的制备 精密称取盐酸麻黄碱10mg 置100mL 的量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，精密吸取2mL 置25mL 的量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，作为盐酸麻黄碱对照品溶液（1mL 含盐酸麻黄碱约0.008mg）。再精密称取苦杏仁苷10mg 置25mL 的量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，精密吸取2mL 置25mL 的量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，作为苦杏仁苷对照品溶液（1mL 含苦杏仁苷约0.032mg）。

表3 水煎煮前浸泡时间比较实验

2.3.3 供试品溶液的制备 精密量取2.1 项下1 ～9 号提取物约0.4g 置具塞锥形瓶中。精密加入甲醇5mL 密塞，称定重量，超声处理45min（制剂与半成品15min，苦杏仁回流1h），放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过。精密量取续滤液1mL，置中性氧化铝柱（内径1cm，100 ～200目中性氧化铝，1.5g，干法装柱）上，用50%甲醇洗脱至9mL，用50%的甲醇稀释至刻度，摇匀，用微孔滤膜（0.45um）滤过，取续滤液作为供试品溶液。

2.4 测定波长的选择

对样品进行全波长扫描，207nm、254nm 有最大吸收：但207nm 响应值较大，且在此波长下阴性样品无干扰，故用207nm。

2.5 线性范围

盐酸麻黄碱进样量麻黄碱在12.3 ～393.6μg范围内呈线性关系，其回归方程为Y=26.766X-0.0813（r=0.9997），苦杏仁苷在0.106 3-4.252 μg 范围内呈线性关系，其回归方程为：Y=1.13×106X+5.12×104（r=0.9995）。

3 水提工艺的正交试验数据结果

按处方比例分别称取麻黄9g、地龙6g、杏仁6g等，总计51g，提取，每次浸泡2h，按正交因素水平表提取，浓缩，干燥，粉碎过80 目筛，得水提药粉备用。以出膏率、盐酸麻黄碱含量、盐酸麻黄碱总量、杏仁苷含量、杏仁苷总量为指标，对提取次数、提取时间、加水量采用正交试验法进行优选。见表2。盐酸麻黄碱的测定方法，参照中国药典2010 版麻黄项下麻黄碱的高效液相测定法[11]。杏仁苷的测定方法，参照药材制剂半成品中麻黄碱、伪麻黄碱和苦杏仁苷的同时定量研究[12]。

3.1 结果分析

按盐酸麻黄碱总量进行方差分析，提取时间B 和加水量C 无显著性差异，根据极差分析，综合考虑出膏率，盐酸麻黄碱含量的结果，最佳条件为A3B1C1；即提取三次，每次1h，加水量为8，6，6；按杏仁苷总量进行方差分析，煎煮次数A、提取时间B、加水量C 都有显著性差异，根据极差分析，综合考虑出膏率，杏仁苷含量的结果，最佳条件为A3B3C2，；综合以上二指标，最佳条件确定为A3B3C2，即提取三次，每次2h，加水量为10，8，8。

3.2 验证试验及水提工艺参数浸泡时间的比较实验

取药材麻黄9g、地龙6g、杏仁6g 等，总计51g，加10，8，8 倍量水，分别浸泡0h，2h，提取3 次，每次2h，以出膏率、盐酸麻黄碱含量、盐酸麻黄碱总量、杏仁苷含量、杏仁苷总量为指标，用正交最优条件，对浸泡时间进行比较,见表3。

结果表明，水提取前浸泡2h 与浸泡0h 未见明显差异，故确定不浸泡。按上述最佳工艺条件制成的双龙颗粒水提部分最佳条件为不浸泡，提取3 次，每次2小时，加10，8，8 倍量水。按此最佳工艺条件得麻黄碱转移率为68.86%；杏仁苷转移率为92.78%，工艺合理。

4 讨论

由于影响药物提取的因素很多，而且这些因素相互作用，单一指标成分的控制难以体现中药效应整体性特征；单一指标成分的变化情况，难以体现制备过程中整体成分的变化情况，以往的复方提取工艺优选，局限于用浸膏得率、某一指标成分的含量进行工艺优选，具有一定的局限性[13]。本实验用多个指标进行评价比较合理。本处方中有九味药材水提，其制剂工艺的评价如采用单一指标则代表性较差，用不同种类的成分作为评判指标其结果才有较广泛的代表性。但由于不同药材中的成分方中地位不一，含量不在同一数量级，故应以一种生物碱为主、一种皂苷为辅的代表性指标来考察各提取因素。麻黄碱为方中君药麻黄的药效成分，其所需提取条件为不浸泡，提取3 次，每次1h，加水量为8，6，6；而佐药杏仁的药效成分杏仁苷在该条件下转移率亦不低于80%，从省时省工的角度出发提取条件为不浸泡，提取3 次，每次1h，加水量为8，6，6。

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