万英明 田 晶 齐 玲 朱辛奕

吉林医药学院附属医院口腔科，吉林吉林 132021

随着社会的发展，人们对口腔修复有了更高的要求，活动义齿、种植牙等因其稳固、美观舒适、咀嚼效率高等优点越来越多的适用于临床[1-3]。磁性附着体是被口腔医学界公认为目前最具发展前景的新型附着体，是用于活动义齿、种植牙的一种优质材料[4-5]。已有报道显示静磁场能使细胞的结构、形态发生改变，这可能是由于磁场引起了细胞骨架的改变[6-8]，而磁性附着体本身具有的静磁场是否对牙周膜细胞骨架产生影响以及怎样的影响是值得关注的问题。本研究采用细胞静磁场加载装置对体外培养的人牙周膜细胞进行静磁场加载研究磁性附着体静磁场对HPLCs 骨架影响，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

胎 牛 血 清（Hyclone，美 国）、DMEM 培 养 基（Gibco，美国）、鼠抗人角蛋白抗体、胰蛋白酶（Gibco，美国），TritonX-100（Rohm&Haas，美国）、Ⅰ型胶原酶（Sigma，美国）、鼠抗人波形丝蛋白抗体（Dako，丹麦）、激光扫描共聚焦显微镜（MRC1024ES型）、图像分析软件（LaserPix，MediaCybernetics，美国）、细胞核荧光标记物（BOBO-3，MolecularProbes，美国）、聚合态肌动蛋白（F-actin）荧光标记物（BODIPYFLphallacidin，MolecularProbes，美 国；BODYPY-Phaloidin，Roche，瑞士）、细胞静磁场加载装置，LSCM（MRC1024ES 型，BioRad，英国）。

1.2 方法

收集我院因阻生或正畸拔除的牙齿在无菌条件下将牙根面中1/3 的牙周膜组织刮下进行HPLCs原代培养，将两次消化后的细胞加入0.1%Ⅰ型胶原酶消化，加入DMEM 培养基（含200mL/L 胎牛血清），置于37℃的CO2孵箱中培养。进行波形丝蛋白和细胞角蛋白染色，取生长良好的第5、6 代人HPLCs 用于实验。细胞静磁场加载：将培养好的HPLCs 分组进行50mT、120mT 的静磁场加载24、48、72h，而对照组细胞培养皿则放在静置培养静磁场加载装置外的CO2孵箱中，其受到的磁场影响约为0.03 ～0.07mT。将所有组细胞爬片用PBS液洗、多聚甲醛固定、PBS 液清洗后滴加BODIPYFL phallacidin 标 记F-actin、BOBO-3 荧 光 标 记 物 标记细胞核，滴加预加入10g/L 的牛血清白蛋白的BODYPY-Phaloidin，37℃孵育1h 后PBS 液清洗最后缓冲甘油封片。用激光扫描共聚焦显微镜以及图像分析软件测定分析细胞长宽比、面积以及细胞骨架蛋白的荧光强度并与对照组对比。

表1 静磁场加载对细胞长宽比、面积的影响（）

表1 静磁场加载对细胞长宽比、面积的影响（）

注：与对照组比较，aP ＜0.05；与24h 比较，bP ＜0.05；两因素方差分析，CP ＜0.05

SMF细胞长宽比 细胞面积（pixel）时（2 4间h） 4.6对75照 ±组0.8 68 2.57 55 0±m0T.5 63 a 2.73 152±0 m0T.4 20 a 0.0 P0 3 247对54照±组9 8 62 197 5204m±T8 6 2 3 12 182705m±T 82 01 0 P.253 48 4.764±0.812 2.164±0.342a，b 1.804±0.843a，b 0.021 19649±6428 10049±8428a 7041±3543a 0.024 72 5.535±0.904 1.695±0.121a，b 1.402±0.424a，b 0.008 18654±3725 6654±3687a 5621±3231a 0.000 P 0.310 0.015 0.013 0.000C 0.631 0.061 0.213 0.001C

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 静磁场加载对细胞长宽比、面积的影响

加载静磁场72h 后，加载50mT 和120mT 静磁场的细胞微丝的细胞面积均减小[F（4，241）=824.351，P ＜0.05]，且加载120mT 静磁场的细胞微丝的细胞面积比加载50mT 静磁场的细胞微丝的细胞面积小[F（2，9）=942.537，P ＜0.05]；随加载时间和加载强度增加，细胞微丝骨架变短，细胞长宽比减小[F（4，241）=1021.205，P ＜0.05]。见表1。

2.2 不同强度静磁场加载后荧光标记的成骨细胞骨架蛋白的荧光强度

加载50mT、120mT 静磁场24、48、72h，细胞核周围成骨细胞骨架蛋白荧光强度均较对照组增强[F（4，241）=1103.672，P ＜0.05]，且受50mT 静磁场加载的成骨细胞骨架蛋白的荧光最强[F（2，9）=1003.241，P ＜0.05]。见表2。

表2 不同强度静磁场加载后荧光标记的成骨细胞骨架蛋白的荧光强度（）

表2 不同强度静磁场加载后荧光标记的成骨细胞骨架蛋白的荧光强度（）

注：与对照组比较，aP ＜0.05；50mT 与120mT 组间比较，bP＜0.05；两因素方差分析，CP ＜0.05

SMF荧光强度时（2 4间h ） 24对.40照±组0.29 28.1 520±m T 0.20 a 28.10290±m0T.1 9 0.0 P 11 48 24.45±0.31 35.10±0.23a，b 31.04±0.21a 0.018 72 24.43±0.28 35.13±0.21a，b 29.68±0.19a 0.016 P 0.201 0.012 0.324 0.000C

3 讨论

细胞骨架是维持细胞基本形态的重要结构，它由微管、微丝和中间纤维构成，其中微丝普遍存在于多种细胞内，在细胞形态维持、分裂与运动中起重要作用，是直接影响细胞的形状的重要成分，它由肌动蛋白与肌动蛋白相关蛋白构成，其中肌动蛋白可以较好地反映微丝的形态结构变化[9-10]。已有报道显示静磁场能使细胞的结构、形态发生改变，这一改变可能是由于磁场引起了细胞骨架的改变有关，而磁性附着体是一种装置利用磁性材料的磁力将修复体吸附到种植体或基牙上从而固位和稳定修复体[6，11-15]，那么磁性附着体本身具有一定强度的静磁场是否对牙周膜细胞骨架产生影响有待进一步研究证明。

本研究采用细胞静磁场加载装置对体外培养的HPLCs 进行静磁场加载观察比较肌动蛋白长宽比、面积以及细胞骨架蛋白的荧光强度来研究磁性附着体静磁场对HPLCs 骨架影响。结果显示：加载静磁场72h，加载50mT 和120mT 静磁场的细胞微丝的细胞面积均减小（P ＜0.05），且加载120mT 静磁场的细胞微丝的细胞面积比加载50mT 静磁场的细胞微丝的细胞面积小；随加载时间和强度增加，胞微丝骨架变短且细胞长宽比减小（P ＜0.05），这与胥春等[6]报道结果相似，提示静磁场如果强度较高、暴露时间较长能对人牙周细胞产生不利影响，应谨慎使用。加载50mT、120mT 静磁场24、48、72h，细胞核周围成骨细胞骨架蛋白荧光强度均较对照组增强（P ＜0.05），且受50mT 静磁场加载的成骨细胞骨架蛋白的荧光最强，这一结果与王胜国等[16]报道结果一致。以上结果说明一定强度的静磁场能使HPLCs 细胞骨架发生一定程度的改建和重组。因此，在磁性附着体的设计和制造中也应尽量避免磁场泄漏，使其最小化，此外在临床操作时应准确将衔铁与磁体对位，从而使静磁场照射强度对牙周组织的影响降到最小。

[1] 张瑞，刘惠莉.种植牙修复牙列缺57 例临床效果分析[J].中国医药科学，2013，3（4）：166-167.

[2] 张志勇，黄伟，赖洪昌，等.Straumann 种植系统7 年回顾性分析[J].上海口腔医学，2008，17（3）：267-271.

[3] 刘伟进，刘沂，刘长虹.活动义齿个性化制作方法[J].广东牙病防治，2010，18（12）：653-657.

[4] 郑成燚，杨凯.磁性体在活动义齿修复中的临床应用体会[J].泸州医学院学报，2011，34（6）：706-708.

[5] 程峰.磁性附着体在活动义齿修复中的应用价值研究[J].中国现代医生，2013，51（20）：32-34.

[6] 胥春，范震，巢永烈，等.磁性附着体静磁场对人牙周膜细胞骨架影响的研究[J].四川大学学报（医学版），2007，38（4）：681-684.

[7] 赵桂芝，林珠，柯杰.恒磁场对牙周膜成纤维细胞结构影响的透射电镜观察[J].实用口腔医学杂志，1994，10（3）：195-196.

[8] Ikehara T , Yamaguchi H, Hosokawa K, et al.Effect s of ELF magnetic field on membrane protein structure of living HeLa cells studied by Fourier transform infrared spectroscopy[J].Bioelectromagnetics，2003，24（7）： 457-464.

[9] Blumenthal NC, Ricci J, Breger L, et al.Effect s of low intensity AC and/ or D C elect romagnetic fields on cell attachment and induct ion of apoptosis [J].Bioelectromagnetics，1997，18（3）： 264-272.

[10] 余从年，胡继鹰.医学细胞生物学导论[M].北京：科学出版社，2000：135-153.

[11] 仇丽鸿，包扬，钟鸣，等.静磁场对大鼠成骨细胞增殖分化功能的影响[J].实用口腔医学杂志，2005，21（5）：606-609.

[12] 仇丽鸿，钟鸣，汤旭娜，等.静磁场对成骨细胞骨形成蛋白2 和Ⅰ型胶原的影响[J].上海口腔医学，2007，16（1）：33-35.

[13] Sakata M, Yamamoto Y, Imamura N, et al.The effects of a static magnetic field on orthodontic tooth movement[J].J Orthod，2008，35（4）： 249-254.

[14] 朱琳琳，仇丽鸿.静磁场对鼠成骨细胞增殖和胞内钙离子浓度的影响[J].实用口腔医学杂志，2008，24（3）：350-353.

[15] 杨凌，巢永烈，杜莉，等.磁性附着体模拟静磁场对人牙周膜成纤维细胞致突变性的研究[J].实用口腔医学杂志，2007，23（3）：369-372.

[16] 王胜国，周力，陈扬熙.不同强度静磁场对成骨细胞细胞骨架改建的影响[J].中国组织工程研究与临床康复，2011，15（15）：2661-2664.