李睿歆，姚婷婷，刘昀昀，谢庆生，谢晓飞，梁金晓，林仲秋

宫颈癌作为最常见的妇科恶性肿瘤，其早期筛查的推广、手术放化疗的综合应用提高了患者的生存率，但肿瘤转移仍是影响预后的重要因素。在一些肿瘤发生转移的过程中，上皮细胞显示出了间质细胞的特性，即发生了上皮间质转化（epithelial mesenchymal transition，EMT），从而脱离原发灶，形成局部或远处转移[1]。调控肿瘤细胞转移的众多因子中，Hes1（hairy and enhancer of split 1）影响骨肉瘤、胰腺癌[2-3]细胞的侵袭，且可导致胃癌、乳腺癌[4-5]细胞的EMT。在宫颈癌SiHa细胞中Hes1有促进增殖、抑制分化的作用[6]，但其对宫颈癌细胞迁移、侵袭的作用尚无定论。本实验主要针对Hes1对宫颈SiHa、HeLa细胞的迁移、侵袭能力的影响及导致该影响的可能机制进行探讨。

1 材料与方法

1.1 材料 人宫颈癌细胞株SiHa、HeLa、C33A、CaSki由中科院上海细胞库购入。低限基本培养基MEM培养基、改良型1640培养基（Hyclone），胎牛血清（BI，百旺），opti-MEM（Hyclone），Hes1小干扰 RNA （siRNA，上海吉玛制药），LiPofectamine 2000试剂（Invitrogen），Trizol、逆转录试剂盒、SYBERⅡ、聚合酶链反应（PCR）引物（TAKALA），Hes1抗体（Abcam），EMT 抗体（CST），Transwell小室（滤膜孔径 8 μm，Corning），基质胶（BD）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 SiHa、HeLa、C33A细胞在含10%胎牛血清的MEM培养基传代培养，CaSki细胞在含10%胎牛血清的改良型1640培养基培养。

1.2.2 siRNA下调Hes1按siRNA及LiPofectamine 2000试剂说明书，将待转序列或阴性对照序列混合，室温反应5 min后加入6孔板中，48 h后收集细胞提取RNA、蛋白，或16 h后种入小室。Hes1备选下调序列有3条，见表1。

表1 Hes1备选下调序列及对照序列引物

1.2.3 实时荧光定量聚合酶链反应（RT-qPCR）检测 常规提取细胞总RNA、逆转录为cDNA后，在BIO-RAD CFX96 Real-Time PCR仪器进行扩增。PCR反应条件为：95℃变性5 s，60 ℃延伸 30 s，循环 40 次后，根据结果统计分析。3′-磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）为内参，引物序列见表2。……