沈国华，蔡华伟综述，赵 祯审校

0 引 言

人类恶性肿瘤的发病机制中，癌基因的激活和抑癌基因的失活是导致肿瘤发生和发展的重要原因。GRIM 是一组可被维甲酸(retinoic acid，RA)/干扰素(interferon，IFN)联合诱导并促进细胞凋亡的基因。Angell 等［1］应用反义基因敲除的方法分离发现了一个新的细胞凋亡相关基因:GRIM-19。自GRIM-19 发现以来，越来越多的研究证实该基因在肿瘤组织中呈低表达或缺失，在肿瘤的发生发展中起到重要作用。文中就GRIM-19 及其相关蛋白在细胞凋亡中的调节通路或作用机制作一综述。

1 GRIM-19 结构及分布

GRIM-19 是GRIM 家族中分子质量最小的，约为16 000，定位于人体19 号染色体p13.2，其序列包括线粒体定位、膜电位调控以及和相关蛋白反应的N 端［2］。

RA 是维生素A 的生物活性代谢产物，对多种肿瘤如急性早幼粒细胞性白血病、头颈部肿瘤等具有诱导细胞分化和促进凋亡的作用。IFN 由一族具有多种功能的多肽分子组成，具有抗病毒、抗增生和免疫调节作用，在宿主抗病毒和抗肿瘤免疫防御中发挥核心作用。RA 或IFN 单独诱导GRIM-19mRNA 和蛋白表达能力很弱，但RA/IFN 联合使用可促使GRIM-19表达能力明显增强［3］。

目前对于GRIM-19 的阳性定位仍存有争议，有些学者最初研究发现GRIM-19 在细胞质和细胞核中均有分布，但以细胞核为主［1］。随后又有研究报道，GRIM-19 主要定位于线粒体复合物I 中，与三磷酸腺苷(Adenosinetriphosphate，ATP)的生成有关［4－5］。Huang 等［6］通过免疫荧光实验对多种组织和细胞进行检测，发现GRIM-19 最主要定位于线粒体中，在细胞核中表达较少。细胞核中出现GRIM-19 的高表达，可能是抗体对核蛋白的非特异性反应所致或者线粒体中GRIM-19 高表达后，释放进入胞核。此外，还有学者提出GRIM-19 的分布可能和细胞类型有关［7］。

GRIM-19 是线粒体中还原型辅酶I(Nicotinamide adenine dinucleotide+H，NADH)脱氢酶复合物的基本功能单位，在线粒体I 型呼吸过程中发挥重要作用。缺失GRIM-19 后，胚泡生长发育不良、迟滞，线粒体结构异常，证明GRIM-19 对胚胎的早期发育至关重要［8－9］。GRIM-19 除参与细胞线粒体的呼吸链功能外，还能通过多种途径和机制启动凋亡，参与肿瘤的发生发展［10－11］;此外，它还与病毒侵袭［12－13］、细菌感染过程有关［14］。

2 GRIM-19 相关蛋白及其在肿瘤发生中的作用

2.1 信号转导和转录活化因子(signal transducers and activator of transcriptions，STATs) STATs 是一种存在于细胞质，与酪氨酸磷酸化信号通道偶联，并在激活后能转入核内与DNA 结合的双功能蛋白。其家 族 成 员 包 括:STAT1、STAT2、STAT3、STAT4、STAT5a、STAT5b 和STAT6，其中STAT3 在组织中分布最广［15－16］。在大多数肿瘤中，STAT3 在生长因子和细胞因子的刺激下发生酪氨酸磷酸化而被活化，启动JAK-STAT 信号传导通路［17］，诱导原癌基因如c-myc，c-fos，c-met 等［18］、细胞周期调节蛋白如cell cycle-regulating proteins (cyclin)D1，cyclin B1，CDK1/cdc2 等［19－20］和凋亡抑制蛋白如B-cell lymphoma protein 2(Bcl-2)、Bcl-XL［17］的表达，并且抑制死亡受体fas 的表达，从而调控肿瘤细胞的形成、生长、凋亡抑制等过程。国内外诸多研究证实STAT3表达水平的异常与乳腺癌、肺癌、消化系统肿瘤等的发生发展，甚至肿瘤的分期、转移情况相关［10，21－26］。

研究显示，STAT3 的反式激活结构域，尤其是727 位上的丝氨酸残基是GRIM-19 的重要结合位点，两者结合后可抑制STAT3 酪氨酸磷酸化，抑制细胞增殖，促进其凋亡［2，27］。Zhang 等［27］研究发现，在未受刺激的细胞中，STAT3 与GRIM-19 是捆绑的关系，两者相互作用。此外，GRIM-19 几乎不和其他STAT 蛋白相互作用，其作用方式与其他负性调控蛋白也不同，与STAT3 结合更具特异性。在STAT1、STAT2 或STAT5a 表达量较高的情况下，GRIM-19也不会和它们发生强烈的相互作用。进一步研究发现GRIM-19 只是抑制了诱导STAT3 基因的表达，而不是抑制它的激活过程或者与DNA 结合的能力。在另一研究中，提出GRIM-19 可能是通过抑制了STAT3 从胞浆向胞核的转移过程，从而抑制了STAT3 的表达［7］。

随后，研究者们更加细致地探讨了GRIM-19 对STAT3 的抑制过程。有研究发现GRIM-19 抑制了肉瘤基因(sarcoma gene，src)介导的转录，同时也抑制与细胞黏附和运动有关蛋白的修饰，进而抑制了src 诱导的细胞转化、黏附和运动等［28－29］。src 是脊椎动物基因组中首个被描述的原癌基因，酪氨酸激酶家族参与了许多重要的生理过程，如细胞生长、分化、黏附、转录等［30］。研究者认为GRIM-19 抑制src诱导的细胞转化是由STAT3 表达降低介导的;同时通过抑制细胞黏附分子的酪氨酸磷酸化(如paxillin、E2 钙黏蛋白、γ-atenin 等)，抑制src 诱导的细胞运动和转移［29］。而不是所有的GRIM-19 抑制作用都依赖于STAT3，在缺少STAT3 的src/GRIM-19 细胞中，GRIM-19 可通过重塑细胞支架，显著抑制src 的活性和其诱导的酪氨酸磷酸化［31－32］。另外，野生型的GRIM-19 突变对于src 的抑制作用明显，而肿瘤诱导的GRIM-19 不能抑制src 诱导的细胞的转移［32］。

Wegrzyn 等［33］发现在线粒体中STAT3 作为呼吸调节器，通过调节复合物I 和Ⅱ来调节代谢功能的变化，对电子传递链功能的优化和保持呼吸链效率方面起着重要作用。这些作用的重要基础就是STAT3 可靶向到线粒体，并且其反式激活结构域(transactivation domain，TAD)，尤其是727 位的残端可快速磷酸化，这与其在胞核中的激活通路无关。另有研究发现，没有线粒体STAT3，原癌基因Ras 诱导的细胞集落在软琼脂上生长障碍，可见线粒体STAT3 对于Ras 诱导的细胞转化也是必不可少的［34］。由此可见，线粒体STAT3 是体内肿瘤细胞成长所必须的，并且可能参与了肿瘤细胞的代谢功能的转变。另外，最新研究表明线粒体GRIM-19 及其对线粒体呼吸链复合物I 的调节作用，可能与先天性免疫功能有关［35］。

Nallar 等［36］对 于GRIM-19 如 何 通 过 抑 制STAT3 抑制细胞生长提出了新的见解。在GRIM-19蛋白N 端的一段序列是肿瘤抑制功能所必需的，这段序列由谷氨酸、天门冬氨酸、甲硫氨酸和脯氨酸［glutamic acid(Q)，aspartic acid(D)，DL-methionine(M)，proline(P)，QDMP］等4 种氨基酸构成，并且具有与病毒RNA 蛋白质相似的结构特点。携带QDMP 点突变基因的GRIM-19 的肿瘤生长速度远远快于空载体的肿瘤或携带野生型的GRIM-19的肿瘤，可见QDMP 残基的点突变引起GRIM-19 抑制细胞生长的能力降低;此外，QDMP 点突变还可导致GRIM-19 丧失抑制细胞运动的能力。研究者还分析了点突变的蛋白对STAT3 依赖基因的表达情况的抑制作用，结果显示野生型的蛋白明显抑制了STAT3 依赖基因的表达，而点突变的蛋白抑制STAT3 的能力大大降低，免疫沉淀实验证实抑制能力的降低或缺失是由于点QDMP 突变的GRIM-19无法与STAT3 相互作用［36］。

2.2 GW112 基因 抗凋亡基因GW112 是从人类原始粒细胞中克隆出来的一个基因，位于人13 号染色体q14.3，编码510 个氨基酸，其蛋白产物为(Olfactomedin 4，OLFM4)的前体。最初关于GW112 的报道只是在溃疡性结肠炎的黏膜上皮隐窝中的高表达［37］。Zhang 等［38］通过一系列实验研究发现，在正常组织中，GW112/OLFM4 表达相对较低，但在许多肿瘤尤其是消化系统肿瘤(如胰腺癌、胃癌和结肠癌等)中呈现显著高表达。报告基因检测实验揭示GW112 主要聚集在细胞质中，少量位于胞核。通过酵母双杂交文库筛选实验发现GW112 与GRIM-19相互作用，诱导了细胞的凋亡，证实了GW112 的过表达可减弱过氧化氢和干扰素联合维甲酸(IFN-β/RA)诱导的细胞凋亡和凋亡基因的表达，加快了肿瘤的生长，说明GW112 是细胞凋亡的重要调节因子。相关研究比较了GW112mRNA 在结肠癌、乳腺癌、肺癌组织和对应的非癌组织中的表达情况，结果显示3 种癌组织的样本中分别有90%、68.8%和84.6%的样本GW112 mRNA 表达增高，并且表达情况与肿瘤的分期、类型等相关［39］。利用逆转录PCR(reverse transcription-polymerase chain reaction，RTPCR)半定量方法检测GW112、GRIM-19 和PIN1 等3 种基因在12 种人肿瘤细胞株中的转录水平，发现具有抗凋亡作用的GW112 应用促凋亡作用GRIM-19 在肿瘤细胞株普遍共存，但两者之间的功能关系有待进一步研究［40］。随后，对胃癌细胞SGC-7901使用腺病毒，介导GRIM-19 的高表达，进而研究GRIM-19 与GW112 的联系机制，并探讨在细胞侵袭和转移中的作用。结果显示，GRIM-19 的高表达不仅下调了GW112 的表达，还降低了NF-κB 的结合活性。NF-κB 可结合到GW112 的启动子，并调节其表达［41］。此外，基于细胞的侵袭和转移的情况取决于细胞降解细胞外基质的能力，研究者们又检测了尿激酶型纤溶酶原激活物、基质金属蛋白酶-2，9 和血管内皮生长因子等3 种物质的分泌均受到抑制。这些结果均表明GRIM-19 作为GW112 的上游调节因子，降低了NF-κB 的结合活性，抑制GW112 的表达，进而抑制细胞的侵袭转移等［42］。

值得注意的是，OLFM4 在细胞周期S 早期阶段表达量大大增加，并且在G2/M 过渡期扮演重要角色，直接影响细胞的增殖［43］。此外，siRNA 诱导的OLFM4 抑制只是引起较小程度的凋亡增加，间接说明GRIM-19 与OLFM4 的相互作用可能一定程度上依赖于STAT3［44］。

2.3 细胞周期抑制剂(p16Ink4a) 细胞周期依赖性蛋白激酶(cyclin-dependent kinases，CDK)是一类调控细胞分裂周期G1-S-G2-M-G0 的丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶［45－46］。细胞周期抑制剂可调控CDK 复合物的形成及其活性，主要包括Kip/Cip 族和Ink 族;其中Ink4 族包括p15、p16、p18 和p19 等4 种蛋白。p16、cyclin D、CDK4/6 和视网膜母细胞瘤蛋白(retinoblastoma，RB)形成的CDK4 通路促进细胞周期的正常运转，而在绝大多数肿瘤中该通路通常失调，p16 与CDK4/6 相互作用，抑制RB 的磷酸化，阻止转录因子E2F1 从RB-E2F1 复合物中释放出来，进而干扰增值基因的转录过程［47］。GRIM-19 可与p16 特异性结合，相互作用，而不会和Ink 其他蛋白结合。GRIM-19 和p16 结合协同抑制了E2F1 依赖基因的表达，进而导致G1 阻滞。当有GRIM-19 存在时，p16-CDK4 复合物上调，而降低了CyclinD1-CDK 复合物。此外，GRIM-19 可单独抑制E2F1 启动的增殖相关基因的转录［44］。

2.4 其他凋亡相关蛋白 Ma 等［48］通过酵母双杂交筛选实验发现，GRIM-19 可与丝氨酸蛋白酶HtrA2 通过物理方式直接结合，大大增强了HtrA2降解抗凋亡蛋白X 相关凋亡抑制剂的作用，增加了细胞的凋亡。NOD2 蛋白质是一类细胞内病原体的识别分子，在先天免疫和获得性免疫中发挥重要作用［49］。Barnich 等［14］发现GRIM-19 与NOD2 相互作用是NOD2 所特有的，未发现GRIM-19 与NOD 族的其他蛋白相互作用。GRIM-19 对于NOD2 识别细菌胞壁酰二肽、激活核因子-κB，并介导黏膜反应至关重要。此外，在Crohn 病变部位黏膜的GRIM-19 mRNA 水平比正常黏膜低。另有研究发现GRIM-19能阻断E6/E6AP 复合体，保护p53 不被降解，并协同p53 抑制肿瘤生长。Rozan 等［51］还发现GRIM-19与Traf4 可相互结合，但具体的作用机制及信号通路尚不明确［50］。

3 结 语

GRIM-19 的生物学功能及作用机制的研究尚处于起步阶段。进一步认识其蛋白的结构、功能、调节方式及其作用机制，深入了解促肿瘤细胞凋亡的信号传导通路以及相关因子是今后研究的重点和热点，这将为肿瘤的诊断、治疗提供新的靶点和研究方向。

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