相云，尚云晓，李淼

（中国医科大学附属盛京医院小儿呼吸内科，沈阳 110004）

·论著·

唾液乳杆菌对哮喘小鼠CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞数量及TGF-β1表达的影响

相云，尚云晓，李淼

（中国医科大学附属盛京医院小儿呼吸内科，沈阳 110004）

目的探讨唾液乳杆菌对哮喘Balb/c小鼠CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞数量及转化生长因子β1（TGF-β1）表达的影响。方法将32只Balb/c雌性小鼠随机分成4组：正常对照组、哮喘组、唾液乳杆菌组和哮喘+唾液乳杆菌组。应用卵蛋白激发方法建立急性哮喘模型，原代提取脾细胞，应用流式细胞仪检测脾淋巴细胞中CD4+CD25+Foxp3+Treg/CD4+T比例，ELISA法测定小鼠脾细胞培养上清液中白细胞介素4（IL-4）、γ干扰素（IFN-γ）、TGF-β1水平。结果哮喘组小鼠脾细胞培养上清液中Th2细胞因子（IL-4）较正常对照组明显增高，而Th1细胞因子（IFN-γ）较对照组明显降低（P＜0.05）；唾液乳杆菌干预组较哮喘组Th2细胞因子（IL-4）水平下降，Th1细胞因子（IFN-γ）水平升高（P＜0.05）；唾液乳杆菌干预组小鼠脾细胞培养上清液中TGF-β1含量明显高于哮喘组（P＜0.05）；哮喘组小鼠脾淋巴细胞中CD4+CD25+Foxp3+Treg/CD4+T细胞比例较正常对照组明显减少（P＜0.05），而唾液乳杆菌干预组则明显高于哮喘组（P＜0.05）。结论CD4+CD25+Foxp3+Treg参与了支气管哮喘的发病过程，唾液乳杆菌可能通过上调CD4+CD25+Foxp3+Treg数量及增加TGF-β1表达调整Th1/Th2失衡，减轻哮喘炎症。

唾液乳杆菌；哮喘；CD4+CD25+Foxp3+Treg；转化生长因子β1

研究表明，支气管哮喘（简称哮喘）是一种伴有免疫功能紊乱的全身变态反应性疾病。哮喘存在Th1/Th2功能失衡，但是针对Th2分泌的细胞因子的治疗不能完全有效减轻哮喘的气道炎症，因此不能将哮喘发病简单归于Th1/Th2功能失衡［1］，近年来又提出了哮喘的“免疫耐受缺陷”假说。生活在人体肠道内的微生物群体参与机体免疫系统的形成、发展与完善，并通过抑制潜在的淋巴细胞反应维系免疫耐受、调节机体Thl与Th2免疫反应平衡，其作用至关重要［2］，因此，在饮食中添加益生菌调节肠道菌群已成为新的抗过敏治疗理念。脾是淋巴细胞接受抗原刺激、发生特异性免疫应答的场所，因此，本研究以原代提取的脾细胞为研究对象，从细胞水平观察唾液乳杆菌对卵蛋白致敏的脾淋巴细胞Th1/ Th2细胞因子、转化生长因子β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）及CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞（regulator T cell，Treg）数量的影响，从体外实验观察唾液乳杆菌对哮喘免疫失衡的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 主要试剂：卵白蛋白（OVA，GradeⅡ，美国Sigma公司）；氢氧化铝干粉（沈阳化工三厂）；康敏元冻干粉（为唾液乳杆菌的口服制剂，台湾东宇生物科技股份有限公司监制）；小鼠白细胞介素4（interleukin-4，IL-4）、γ干扰素（interferon-γ，IFN-γ）、转化生长因子β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）ELISA试剂盒（美国R&D公司）；DMEM培养基（美国Gibco公司），胎牛血清（美国Hyclone公司），红细胞裂解液（北京索莱宝科技有限公司）；Anti-Mouse CD4 FITC、Anti-Mouse CD25 APC、Anti-Mouse/Rat Foxp3 PE、Rat IgG2a K Isotype Control PE、Foxp3 Staining Buffer Set（美国eBioscience公司）。

1.1.2 实验动物：健康雌性SPF级Balb/c小鼠，4周龄，体质量16～18 g，由中国医科大学附属盛京医院动物实验室提供。

1.2 方法

1.2.1 动物分组和模型建立：根据随机化分配原则将32只SPF级Balb/c小鼠分为4组，每组8只。（1）哮喘组（asthma group）：于实验第1、8、15天应用OVA和氢氧化铝混合液0.2 mL（OVA 40 μg，氢氧化铝4.5 mg）腹腔致敏，于第22天开始，将小鼠置于自制密闭容器（20 cm×20 cm×20 cm）中，以4%OVA超声雾化吸入，30 min/次，1次/d，连续7 d；（2）哮喘＋唾液乳杆菌组（asthma+Las group）：第1次腹腔致敏前2周开始应用唾液乳杆菌灌胃，用小鼠饮用水溶解益生菌冻干粉，灌胃0.5 mL（约含活菌量0.5×109cfu），1次/d，直至实验结束；（3）正常对照组（control group）：以等量生理盐水代替OVA进行腹腔致敏和激发；（4）唾液乳杆菌组（Las group）：用等量生理盐水代替OVA进行腹腔注射和雾化吸入，灌胃量及起止天数同哮喘+唾液乳杆菌组。

1.2.2 标本采集：无菌条件下取出造模后小鼠的脾脏，PBS清洗2次，用针头碾碎组织形成细胞悬液；200目筛网过滤，1 000 r/min离心5 min，去上清，留沉淀；PBS清洗细胞2次，1 000 r/min离心10 min，去上清，留沉淀；加入红细胞裂解液2 mL，重悬细胞后，室温孵育5 min，1 000 r/min离心10 min。调整浓度后部分用于流式检测，部分用于细胞培养（称取0.5 g卵蛋白，溶解于10 mL含10%FBS的DMEM培养基中），接种于24孔板中（2×106个/孔），每组3个复孔，72 h后收集上清，用于ELISA检测。

1.2.3 流式细胞仪检测脾淋巴细胞中CD4+CD25+Foxp3+Treg/CD4+T细胞比例：调整流式管内的液体体积为100 μL，加入荧光标记CD4、CD25抗体（浓度分别为每管0.125 μg、0.06 μg），对照管1加入“Affinity Purfied anti-mouse CD16/32（Fc Block）”（每管1 μg）；避光4℃孵育30 min；用预冷Flow Cytometry Staining Buffer洗涤细胞；涡旋振荡重悬细胞后，加入1 mL固定/破膜工作液，再次涡旋混匀，避光4℃孵育40 min；加入2 mL稀释Permeabilization Buffer洗涤细胞，离心后弃上清；重复上一步洗涤细胞；加入2%大鼠血清，避光4℃孵育15 min；加入Foxp3-PE标记的抗体（每孔0.5 μg），对照管2加入IgG2a-PE标记的抗体（每管0.5 μg），避光4℃孵育30 min。加入2 mL稀释Permeabilization Buffer洗涤细胞，离心后弃上清；重复上一步洗涤细胞。用500 μL Flow Cytometry Staining Buffer重悬细胞，上机检测。

1.2.4 ELISA法检测细胞培养上清液中IL-4、IFN-γ、TGF-β1浓度水平：严格按照试剂盒说明书进行操作。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 小鼠脾细胞培养上清液ELISA检测结果

哮喘组脾细胞培养上清液中IL-4水平较对照组明显升高，差异有统计学意义（P＜0.05）；而哮喘+唾液乳杆菌组IL-4水平较哮喘组明显降低（P＜0.05），但仍高于对照组（P＜0.05）；单纯唾液乳杆菌灌胃组IL-4水平较对照组降低（P＜0.05）。哮喘组脾细胞培养上清液中IFN-γ水平较对照组明显降低，差异有统计学意义（P＜0.05）；而哮喘+唾液乳杆菌组IFN-γ水平较哮喘组明显升高（P＜0.05），但仍低于对照组（P＜0.05）；单纯唾液乳杆菌组IFN-γ水平较对照组升高（P＜0.05），见表1。

表1 各组小鼠脾细胞培养上清液IL-4、IFN-γ含量比较（pg/mL）Tab.1 The levels of IL-4 and IFN-γ in the supernatant of splenocyte culture of each group（pg/mL）

哮喘+唾液乳杆菌组脾细胞培养上清液中TGF-β1水平较哮喘组明显升高，差异有统计学意义（P＜0.05）；单纯唾液乳杆菌灌胃组TGF-β1水平较对照组及哮喘组均升高（P＜0.05），见图1。

2.2 脾淋巴细胞中CD4+CD25+/CD4+T、CD4+CD25+Foxp3+Treg/CD4+T细胞比例检测结果

图1 脾细胞培养上清液中TGF-β1水平Fig.1 TGF-β1 level in the supernatant of cultured splenocytes

哮喘组无论在CD4+CD25+T细胞和CD4+CD25+Foxp3+T细胞比例上均低于正常对照组及唾液乳杆菌干预组，差异有统计学意义（P＜0.05）；哮喘+唾液乳杆菌组CD4+CD25+Foxp3+T细胞比例较哮喘组明显升高（P＜0.05），但仍低于唾液乳杆菌组及正常对照组（P＜0.05），唾液乳杆菌组较正常对照组升高（P＜0.05）。见表2，图2、3。

表2 脾淋巴细胞中CD4+CD25+/CD4+T、CD4+CD25+Foxp3+/CD4+T（，%）Tab.2 CD4+CD25+/CD4+T and CD4+CD25+Foxp3+/CD4+T in splenic lymphocytes（，%）

表2 脾淋巴细胞中CD4+CD25+/CD4+T、CD4+CD25+Foxp3+/CD4+T（，%）Tab.2 CD4+CD25+/CD4+T and CD4+CD25+Foxp3+/CD4+T in splenic lymphocytes（，%）

1）P＜0.05 vs control group；2）P＜0.05 vs asthma group.

Group CD4+CD25+/CD4+T CD4+CD25+FOXP3+/CD4+T Control 9.83±0.02 8.35±0.05 Las 10.47±0.172） 8.64±0.061），2）Asthma 7.11±0.031） 5.37±0.071）Asthma+Las 9.43±0.041），2） 7.90±0.031），2）

3 讨论

Thl/Th2免疫应答失衡、Th2优势应答是哮喘形成及发展的关键性机制［3］。卫生学假说表明免疫调节机制能保持T h1和Th2细胞反应的平衡，但在相对缺乏微生物刺激时则不能完全成熟［4］。益生菌是最主要、也是最早的人体所暴露的肠道共生菌，研究已经表明益生菌特定的菌株能够刺激并调节先天和获得性免疫反应［5］。

近年来，生长因子与哮喘的关系得到学者们的广泛关注，TGF-β1在哮喘气道结构变化中作为重要的致纤维化和免疫调节因子而起作用，体内外实验都已证实了这种双重调节作用［6］，它可作为促炎因子或抗炎因子作用于炎性细胞参与气道的炎症和免疫反应的开始。

本研究中，哮喘组脾细胞培养上清液中Th2细胞因子IL-4较正常对照组明显升高，而Th1细胞因子IFN-γ较对照组明显降低，差异均有统计学意义。哮喘＋唾液乳杆菌组IL-4水平较哮喘组明显降低，而IFN-γ水平则较哮喘组显著升高，这一结果与Inoue等［7］观察短双歧杆菌M-16V干预对卵蛋白致敏的脾细胞在体外接受OVA再刺激时细胞因子IL-4和IFN-γ的变化相一致。因此，认为唾液乳杆菌干预可以增强卵蛋白致敏脾淋巴细胞Th1免疫反应，并抑制Th2免疫反应。本研究结果还显示，单纯唾液乳杆菌灌胃组脾细胞培养上清液中IFN-γ水平较对照组提高，IL-4水平较对照组降低，提示一定的益生菌菌株在无特定抗原的刺激下仍可能发挥免疫调节的作用。因此，本研究从细胞水平体外实验证明唾液乳杆菌能够减轻哮喘Th1/Th2失衡。且唾液乳杆菌干预的哮喘小鼠脾细胞培养上清液TGF-β1含量均高于哮喘组，推测TGF-β1可能参与了唾液乳杆菌对哮喘小鼠的气道保护作用机制。

图2 CD4+CD25+T细胞占CD4+T细胞的百分比Fig.2 The percentage of CD4+CD25+T cells in CD4+T cells

对辅助性T细胞（Th）分化调节功能的深入研究发现还存在一个功能和细胞因子产生方面既不同于Thl也不同于Th2的T细胞亚群，称为Treg。Treg可分为4种亚型，CD4+CD25+Treg是Treg的主要组成部分。Treg可明显抑制Thl、Th2活化增殖，是在Th1/Th2网络平衡之上的更高层次调控者［8］。CD4+CD25+Treg具有免疫无能性和抑制性两大功能特征［9］，IL-10和TGF-β1是Treg发挥免疫抑制作用的主要细胞因子［10］，叉状头/翅膀状螺旋转录因子（forkhead/winged helix transcriptionfactor，Foxp3）特异地高表达于CD4+CD25+Treg，在一定程度上反映CD4+CD25+Treg的水平和功能活性，已被公认为Treg特异性的标志物［11，12］，Bakr等［13，14］研究发现哮喘组CD4+CD25+Foxp3+T淋巴细胞水平明显低于健康对照组，王炜等［15］研究发现与健康对照组比较，轻、中度哮喘患儿调节性T淋巴细胞数量没有减低，但存在功能障碍；而重度哮喘患儿不仅存在调节性T淋巴细胞功能障碍，而且出现数量减低。与既往研究一致，本研究发现哮喘组小鼠脾淋巴细胞中CD4+CD25+Foxp3+Treg/CD4+T细胞的比例较对照组明显下降，进一步证实了CD4+CD25+Treg数量减少及功能低下可能是哮喘发病的一个重要原因，唾液乳杆菌可能通过上调CD4+CD25+Treg数量并促进其功能，从而减轻哮喘的Th1/Th2失衡。Peng等［16］的研究则证实TGF-β是启动CD4+CD25+Treg细胞体内扩增的重要分子，Cobbold等［17］也发现CD4+CD25+Treg细胞在维持移植耐受过程存在TGF-β依赖机制，本研究中唾液乳杆菌诱导的CD4+CD25+Treg细胞可能通过分泌抑制性细胞因子TGF-β1来介导免疫抑制作用。

综上所述，本研究进一步支持了口服益生菌能够发挥免疫调节功能且不局限于胃肠道的理念，免疫耐受机制缺陷在哮喘等变态反应性疾病的发病中起重要作用。随着对耐受机制研究的深入，逆转免疫耐受缺陷，益生菌制剂可能会成为未来防治哮喘等过敏性疾病的有益帮手。

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图3 CD4+CD25+Foxp3+T细胞占CD4+T细胞百分比Fig.3 The percentage of CD4+CD25+Foxp3+T cells in CD4+T cells

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（编辑王又冬）

Effect of Lactobacillus salivarius on the Number of CD4+CD25+Foxp3+Treg Cells and the Expression of TGF-β1 in Asthma Balb/c Mice

XIANG Yun，SHANG Yun-xiao，LI Miao

（Department Of Pediatrics，Shengjing Hospital，China Medical University，Shenyang 110004，China）

ObjectiveTo explore the effect of Lactobacillus salivarius on the number of CD4+CD25+Foxp3+Treg cells and expression of transforming growth factor β1（TGF-β1）in asthma Balb/c mice.MethodsThirty-two female Balb/c mice were randomly divided into four groups：the normal control group，the asthma group，the Lactobacillus salivarius group，and the asthma combined Lactobacillus salivarius group.Acute asthma model was established by the ovalbumin challenge method.After extraction of primary spleen cells，flow cytometry was used to test CD4+CD25+Foxp3+Treg/CD4+T ratio in spleen lymphocytes.The levels of IL-4，IFN-γ and TGF-β1 in the spleen cell culture supernatant were measured by ELISA method.ResultsThe level of Th2 cytokine（IL-4）in the spleen cell culture supernatant of the asthma group was significantly higher than that of the control group（P＜0.05），however，the level of Th1 cytokine（IFN-γ）was significantly lower than that of the control group（P＜0.05）.The expression level of Th2 cytokine（IL-4）in the Lactobacillus salivarius intervention group was significantly decreased compared with the asthma group，and the Th1 cytokine（IFN-γ）expression level was elevated compared with the asthma group（P＜0.05）.The level of TGF-β1 in the Lactobacillus salivarius intervention group was higher than in the asthma group（P＜0.05）.The proportion of CD4+CD25+Foxp3+Treg/CD4+T in spleen lymphocytes in the asthma group was lower than that in the control group（P＜0.05），and was higher in the Lactobacillus salivarius intervention group than in the asthma group（P＜0.05）.ConclusionCD4+CD25+Foxp3+Treg was associated with the pathogenesis of asthma.Lactobacillus salivarius could adjust Th1/Th2 imbalance and reduce asthma inflammation through up-regulation ofCD4+CD25+Foxp3+Treg and TGF-β1 expression.

Lactobacillus salivarius；asthma；CD4+CD25+Foxp3+Treg；TGF-β1

R562.25

A

0258-4646（2015）06-0552-06

相云（1979-），女，讲师，博士.

尚云晓，E-mail：shangyx@sj-hospital.org

2015-01-06

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