王齐晖，满冬亮，何川，程仕彤

（中国医科大学附属第一医院检验科，沈阳 110001）

·论著·

孕激素和维生素D对激素依赖性乳腺癌细胞增殖的影响及其相互作用

王齐晖，满冬亮，何川，程仕彤

（中国医科大学附属第一医院检验科，沈阳 110001）

目的探讨孕激素对激素依赖性乳腺癌细胞增殖的影响，观察不同水平维生素D以及孕激素对激素依赖性乳腺癌细胞系T-47D细胞增殖的共同作用及二者之间的相互作用。方法将培养的T-47D细胞分为单纯高、低浓度孕激素处理组，观察孕激素对激素依赖性乳腺癌细胞增殖的影响；设单纯高、低浓度维生素D处理组，观察维生素D对T-47D细胞增殖的影响；设高、低浓度孕激素与高、低浓度维生素D处理组，采用两因素两水平平行析因实验设计，观察不同水平维生素D及孕激素对T-47D细胞增殖的共同作用，对照组为正常培养乳腺癌细胞。采用MTT法检测各组吸光度，观察细胞生长凋亡情况。结果高、低浓度孕激素处理组细胞浓度均显著高于对照组，且低浓度孕激素处理组细胞浓度显著高于高浓度孕激素处理组（P＜0.05）；双低组（低浓度维生素D、低浓度孕激素处理组）细胞浓度显著低于其他3个双因素处理组及对照组（P＜0.05）。结论孕激素对激素依赖性乳腺癌细胞增殖有促进作用。维生素D和孕激素存在相互作用，且这种相互作用根据二者的浓度不同而有所变化，提示孕激素对乳腺癌细胞的双向作用可能与孕激素和（或）其他因素的浓度有关，但其具体机制尚不明确。

孕激素；维生素D；乳腺癌；增殖

乳腺癌是常见的肿瘤，严重威胁着女性健康。自20世纪70年代末开始，全球乳腺癌发病率呈上升趋势。2009年我国肿瘤登记地区乳腺癌发病率位居女性恶性肿瘤的第1位，发病率（粗率）合计42.55/10万，城市为51.91/10万，农村为23.12/10万［1］。

根据激素受体的表达情况，乳腺癌分为激素依赖性乳腺癌和激素非依赖性乳腺癌，其中以前者居多。目前，乳腺癌的内科治疗以内分泌疗法为主，即采用雌激素抑制剂阻断激素对肿瘤细胞生长侵袭的促进作用。但内分泌疗法仅对50%～60%的激素依赖性乳腺癌患者有效，且只对不到10%的激素非依赖性乳腺癌患者有效，其原因尚不明确。

维生素D除能够调节人体内的钙磷代谢外，还能通过与其受体（vitamin D receptor，VDR）结合，抑制肿瘤细胞生长和血管生成，促进肿瘤细胞凋亡。研究发现，血清中维生素D含量与乳腺癌发病风险呈负相关，晚期乳腺癌患者血液中维生素D水平极低［2］。体外实验表明，活性维生素D与其模拟物能够显著抑制乳腺癌细胞的生长［3～6］。研究发现，某些维生素D匮乏的中晚期乳腺癌患者内分泌治疗或化疗疗效欠佳，而补充维生素D后疗效提升，且这种效果对于激素依赖性乳腺癌患者尤为明显。由此推测，维生素D与能够影响激素依赖性乳腺癌细胞生长凋亡的激素之间可能存在某种负相关的联系，而这种相互作用能够对肿瘤细胞的生长增殖、凋亡和各种治疗方案的疗效产生一定影响。

能够对激素依赖性乳腺癌细胞产生作用的最明确的激素为雌激素和孕激素，此外，垂体激素可能也会有一定作用［7］。促进激素依赖性乳腺癌细胞生长增殖作用最为明确的是雌激素，而孕激素对激素依赖性乳腺癌的作用却广存争议，有促进和抑制2种截然相反的结论。使孕激素对激素依赖性乳腺癌产生相反作用的决定性的实验条件尚不明确。本研究拟采用典型的激素依赖性乳腺癌细胞系（T-47D）细胞，探讨不同水平孕激素对其影响；再进行两因素两水平平行析因实验，探讨维生素D与孕激素之间的相互作用以及对细胞产生的综合作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试剂：维生素D3注射液（上海通用药物股份能有限公司）；黄体酮（孕激素）注射液（天津金耀氨基酸有限公司）；DMEM（Thermo SCIENTIFIC赛默飞世尔生物化学制品北京有限公司）；胎牛血清（天津市灏洋生物制品科技有限责任公司）；胰酶（天津市灏洋生物制品科技有限责任公司）。

1.1.2 人乳腺癌细胞株T47D：购自中科院上海生命科学研究院细胞资源中心。

1.2 方法

1.2.1 试剂的配制：用倍比稀释法将维生素D3注射液（7.5 mg/mL）、黄体酮注射液（10 mg/mL）配制成20 mL含不同浓度药物的DMEM培养基（表1）。4℃保存备用。

1.2.2 细胞培养：T47D细胞株常规培养于含10%胎牛血清DMEM培养基中，于37℃、5%CO2条件下培养。取对数生长期细胞传代备用，4～5 d传代1次。

1.2.3 细胞分组：设单纯高、低孕激素处理组（vd-pr++组、vd-pr+组）观察孕激素对激素依赖性乳腺癌细胞增殖的影响；设单纯高、低维生素D处理组（vd++pr-组、vd+pr-组）观察维生素D对激素依赖性乳腺癌细胞增殖的影响，对照组为未添加维生素D和孕激素的正常培养的乳腺癌细胞；设高、低孕激素与高、低维生素D处理组，即vd++pr++组、vd+pr++组、vd++pr+组、vd+pr+组，采用两因素两水平平行析因实验设计，观察不同水平维生素D和孕激素对T-47D细胞增殖的共同作用，对照组为正常培养乳腺癌细胞。

表1 药物浓度（ng/mL）Tab.1 Drug concentration（ng/mL）

1.2.4 MTT法检测细胞生长凋亡情况：各组均同时同生长条件培养6 d，每24 h取对数生长期细胞3瓶，弃DMEM培养基，生理盐水涮洗后，用胰酶消化约1 min。加入6 mL DMEM培养基，将细胞悬液浓度调整为4×105/mL，平均分成8组，每组4个复孔，共5板。离心，加入提前配好的DMEM培养基3.6 mL混匀，加入96孔板（100 μL/孔）。于5%CO2、37℃温箱中分别孵育24、48、72、96、120 h，倒置显微镜下观察细胞生长状态。每天取1板，加入0.5%MTT溶液（20 μL/孔），继续培养4 h后终止培养，弃孔内培养液。每孔加入150 μL二甲基亚砜，低速振荡10min，使结晶物充分溶解。设置调零孔（培养基、MTT、二甲基亚砜）和对照孔（药物处理孔）。酶联免疫检测仪检测各孔吸光度值（OD490nm）。

1.3 统计学分析

利用SPSS17.0软件进行统计学分析。采用ANOVA分析方法判断孕激素作用下维生素D对乳腺癌细胞的影响，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

与vd-pr-组相比，vd-pr+组和vd-pr++组的吸光度值显著增高（P＜0.05）；vd+pr+组的吸光度值显著降低（P＜0.05）；其余各组均无统计学差异。见表1，图1。与vd-pr++组相比，vd-pr+组的吸光度值显著升高，差异有统计学意义（P=0.028）。

表1 各组细胞吸光度值的比较（）Tab.1 The comparison of absorbance between each group of cells（）

表1 各组细胞吸光度值的比较（）Tab.1 The comparison of absorbance between each group of cells（）

Group OD490nm P vd-pr- 0.75±0.29 vd-pr+ 1.66±0.25 0.000 vd-pr++ 1.31±0.16 0.001 vd++pr- 0.79±0.11 0.791 vd++pr+ 0.85±0.22 0.492 vd++pr++ 0.69±0.16 0.735 vd+pr- 0.59±0.03 0.303 vd+pr+ 0.43±0.05 0.042 vd+pr++ 0.89±0.11 0.343

图1 各组细胞的生长状态Fig.1 Growing status of each group

与vd+pr+组相比，vd++pr+组、vd+pr++组及vd++pr++组的吸光度值显著增高，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

表2 双因素处理组与vd+pr+组吸光度值的比较（）Tab.2 The comparison of absorbance between two-factor treated groups and vd+pr+group（）

表2 双因素处理组与vd+pr+组吸光度值的比较（）Tab.2 The comparison of absorbance between two-factor treated groups and vd+pr+group（）

Group OD490nm P vd++pr+ 0.85±0.22 0.010 vd+pr++ 0.89±0.11 0.005 vd++pr++ 0.69±0.16 0.025

3 讨论

本研究结果表明，孕激素能够促进激素依赖性乳腺癌细胞增殖。首先，孕激素是乳腺发育所必需的类固醇激素，通过与其特异性受体结合调控乳腺组织的正常发育，促进乳腺小叶及腺泡生长，促进乳腺上皮增殖［8］。而在绝经后长期接受激素补充治疗妇女的乳腺组织学研究中发现，雌激素联合能明显增加终末导管小叶细胞的增殖率，这种作用比单一雌激素治疗明显，且随着激素治疗时间延长而增强。Pike等［9］认为对更年期妇女施以激素补充治疗，其患乳腺癌的风险不同：单独服用雌激素则风险每5年增加10%，而联合服用雌激素和孕激素，风险每5年将增加29%。另有研究指出，接受雌孕激素复合制剂疗法（HRT）的妇女罹患侵袭性乳腺癌的风险增高，而仅接受雌激素疗法（ERT）的妇女患乳腺癌的风险未增加。这些研究间接支持了孕激素对乳腺癌发生发展的促进作用。研究发现，在BRCA1低表达的乳腺癌细胞中，孕激素大量积累，导致乳腺细胞过度增殖，促进了乳腺癌的发生和发展，而使用孕酮拮抗剂可防止或推迟乳腺癌发展［10］。还有研究指出孕激素可促进乳腺癌细胞的增殖和迁移，且推论BRCA1可能通过下调孕激素受体表达抑制由孕激素所致乳腺癌细胞增殖和迁移，解释了BRCA1缺失或低表达的人群更易罹患乳腺癌且病情发展更快的原因。研究认为孕激素能刺激双调蛋白的增加，并与双调蛋白一起经由表皮生长因子受体途径激活细胞内通路，促进正常和肿瘤细胞的生长和增殖。

而另有研究者通过实验表达了相反的观点。研究者通过基因分析发现激素非依赖性乳腺癌细胞在转染雌激素受体后，雌激素能抑制多种与乳腺癌增殖和转移相关的基因，并且能刺激多种肿瘤抑制因子的表达，从而抑制肿瘤细胞的增殖和转移［9］。也有许多研究结果间接地支持了这一论点，如有研究表明术后复发率与孕激素浓度值呈显著负相关［2］，孕激素能下调雌激素和孕激素受体的生成［13］，孕激素高表达预示患者有较高的生存率和较长的生存期，以及乳腺癌手术前单次大剂量注射孕激素对淋巴结转移患者的生存期有改善作用等［9］。而临床乳腺癌治疗中也将大剂量的孕激素类（如甲孕酮和甲地孕酮等）用于复发转移乳腺癌的解救治疗或与化疗合用以提高疗效，减轻化疗不良反应。其中，甲孕酮对治疗复发转移乳腺癌疗效肯定，当TAM治疗失败时改用甲孕酮仍有较高的有效率。雌激素受体和孕激素受体均表达者有效率可达50%，只表达孕激素受体而不表达雌激素受体者也有20%～30%的有效率。本研究结果发现，高浓度孕激素对激素依赖性乳腺癌细胞增殖的促进作用明显低于低浓度孕激素，而更高的浓度是否可以逆转促进作用尚不可知，但提示了孕激素的浓度或局部浓度有可能是影响其对乳腺癌细胞的增殖产生促进或抑制作用的重要原因之一。

本研究结果还表明，维生素D处理组虽然没能明显抑制T47D细胞的生长，但维生素D的存在显著降低了孕激素对T47D细胞增殖的促进作用。根据报道的维生素D和孕激素的独立作用，即高浓度维生素D抑制作用大，高浓度孕激素促进作用小，预测的结果应当是高浓度维生素D和高浓度孕激素的联合作用组对细胞增殖的抑制作用最明显，而事实却恰好相反，低浓度维生素D和低浓度孕激素联合作用组才是抑制作用最明显的，也是在实验结束时与对照组相比唯一细胞数显著减少的处理组。而其他3组的发展趋势则非常相近，在实验结束时细胞数几乎与对照组相同。提示孕激素和维生素D之间必然存在着某种作用，使双低浓度下的细胞受到了明显的抑制甚至打击，而其他处理组，包括预测中本应是效果最好的一组，抑制作用几乎相同，最后的细胞数都与对照组相近，即最终经由某种机制，维生素D和孕激素间的相互作用使维生素D降低了孕激素的促进作用；另一方面，在双低组中，二者的相互作用经由某种途径使维生素D对细胞的抑制作用得到了加成的效果。在实验初期，镜下观察几乎未发现凋亡细胞，而随着实验的进行，凋亡细胞逐渐增多，所有处理组均如此，然而最终却只有双低处理组的细胞数显著降低，说明只有这组的凋亡数大于增殖数，可能是因为维生素D促凋亡的作用得到了提升，或孕激素的促增殖作用被降低，当然也可能是孕激素对维生素D促凋亡作用的抑制被抵消。

综上所述，本研究证实了孕激素对激素依赖性乳腺癌细胞具有促增殖作用，并进一步发现了维生素D和孕激素存在相互作用，且这种相互作用随二者的浓度不同而有所变化。孕激素对乳腺癌细胞产生的双向作用有可能与孕激素和（或）其他因素的浓度有关，但其具体相互作用关系和机制尚不明确，还需进一步深入研究。

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（编辑王又冬）

Influence of Progesterone and Vitamin Don the Cell Proliferation of Hormone-dependent Breast Cancer and the Interaction

WANG Qi-hui，MAN Dong-liang，HE Chuan，CHENG Shi-tong

（Department of Laboratory Medicine，The First Hospital，China Medical University，Shenyang 110001，China）

Objective To study the influence of progesterone on the cell proliferation of hormone-dependent breast cancer and observe the co-effect of vitamin D and progesterone of different levels on the proliferation of the cell line T-47D in hormone-dependent breast cancer and the interaction between vitamin D and progesterone.MethodsThe cultured T-47D cells were divided into the high and the low progesterone mono-treated groups to observe the effects of different levels of progesterone on the cell proliferation of hormone-dependent breast cancer cell line（T-47D）.The high and the low vitamin D mono-treated groups were set to observe the effects of different levels of vitamin D on the cell proliferation.Groups treated by different levels of progesterone combined with vitamin D were set to observe the interaction between them.Normal breast cancer cells were set as the control group.The two-factor two-level parallel factorial experiment was conducted to observe the co-effect of different levels of progesterone and vitamin D on the proliferation of T-47D.The growth and apoptosis of cells was observed through detection of absorbance in each group by MTT.ResultsThe cell concentration in high and low progesterone treated groups was increased than that in the control group，and was increased in the low progesterone treated group compared with the high progesterone treated group（P＜0.05）.The cell concentration in dual-low level treated group was decreased than that in the other three groups which were two-factor treated and the control group（P＜0.05）.ConclusionProgesterone stimulates the cell proliferation of hormone-dependent breast cancer.The concentration-based interaction between vitamin Dand progesterone indicates that the bidirectional effect of progesterone on breast cancer cells may be related to the concentration of progesterone and other factors，but the specific interaction and the mechanism is unclear.

progesterone；vitamin D；breast cancer；proliferation

R737.9

A

0258-4646（2015）06-0509-04

2013年度留学人员科技活动择优资助项目；沈阳市科技计划项目人口与健康科技攻关专项（F14-158-9-34）

王齐晖（1984-），男，检验师，本科.

程仕彤，E-mail：stdyefeng@hotmail.com

2015-04-01

网络出版时间：