刘阳，王占友，池志宏，王涛

（1.辽宁医学院附属第三医院医学检验中心，辽宁 锦州 121000；2.中国医科大学基础医学院病理生理学教研室，沈阳 110001；3.东北大学生命健康科学学院神经科学研究所，沈阳 110015）

·论著·

SLC30A8基因rs13266634 C/T单核苷酸多态性与2型糖尿病易感性的相关性研究

刘阳1，2，王占友2，3，池志宏2，王涛3

（1.辽宁医学院附属第三医院医学检验中心，辽宁 锦州 121000；2.中国医科大学基础医学院病理生理学教研室，沈阳 110001；3.东北大学生命健康科学学院神经科学研究所，沈阳 110015）

目的探讨SLC30A8基因rs13266634 C/T单核苷酸多态性（SNP）与锦州地区2型糖尿病（T2DM）易感性之间的相关性。方法基于病例-对照分析，采用聚合酶链反应（PCR）-高分辨率溶解曲线（HRM）方法对锦州地区136例2型糖尿病患者（T2DM组）和145例健康对照（NC组）SLC30A8基因rs13266634位点的单核苷酸多态性进行检测。结果CC基因型频率T2DM组（38.23%）高于NC组（22.07%）；C等位基因频率T2DM组（61.76%）高于NC组（51.03%），差异均具有统计学意义（P＜0.05）；等位基因C增加了2型糖尿病1.550倍患病风险（OR=1.550，95%CI：1.108～2.169，P＜0.05）。结论SLC30A8基因rs13266634 C/T单核苷酸多态性与锦州地区T2DM的发病相关，C是风险等位基因。

SLC30A8基因；单核苷酸多态性；高分辨率溶解曲线；2型糖尿病

2型糖尿病（type 2 diabetes mellitus，T2DM）具有明显的遗传倾向，其遗传度为31%～69%［1］，属于复杂的多基因遗传病。基于全基因组关联研究（genome-wide association study，GWAS），在法国人群中首次发现SLC30A8基因和2型糖尿病相关［2］。随后，在不同种群开展了其重复研究与荟萃分析［3～6］，研究结果显示，SLC30A8基因的rs13266634是与2型糖尿病最相关的遗传易感位点。由于种族和地域的差异，所得研究结果也不尽相同［7］。因此，本文基于病例-对照研究，通过聚合酶链反应-高分辨率溶解曲线法［8］检测SLC30A8基因rs13266634 C/T遗传位点的单核苷酸多态性，旨在探讨锦州地区人群中此位点的分布及对2型糖尿病的风险预测。

1 材料与方法

1.1 研究对象

选取2013年12月至2014年12月辽宁医学院附属第三医院门诊就诊的T2DM患者（T2DM组）136例，皆为北方地区汉族，并且彼此无任何亲缘关系。男65例，女71例，平均年龄（51.42±10.23）岁；排除严重的心肝肾疾病患者，患者均符合1999年WHO糖尿病诊断标准。另外，选取同一时期门诊就诊的健康体检正常人145例为正常对照（NC组），其中男69例，女76例，平均年龄（52.63±13.21）岁。2组在年龄和性别构成上差异均无统计学意义（P＞0.05）。均取得所有研究对象的知情同意。

1.2 方法

1.2.1 试剂与仪器：基因组DNA提取试剂；2×PCR Reaction Mix（上海申能博彩生物科技有限公司）。SYTO®9 green fluorescent nucleic acid stain（InvitrogenTM-MolecularProbesTM，美国）；Rotor-Gene荧光定量PCR仪器（Corbett公司），凝胶图像分析系统（上海天能科技有限公司），凝胶电泳仪（上海天能科技有限公司）。

1.2.2 基因组DNA的提取：采用常规苯酚-氯仿法进行基因组DNA提取作为模板，并对DNA含量进行分析、测定，-80℃保存，备用。

1.2.3 引物设计：根据UCSC genome browser（http：// genome.ucsc.edu/）获得所需 SLC30A8基因的rs13266634SNPs的资料，基于PRIMER5.0设计高分辨率溶解曲线（high resolution melting，HRM）引物。引物设计原则确保扩增产物片段控制在50～200 bp。

1.2.4 PCR-HRM反应体系建立：根据文献［8］，建立相应的PCR-HRM反应体系。PCR反应体系25 μL，2×PCR的反应MIX 12.5 μL，上下游引物各1.5 μL，5 μmol/L SYTO9荧光染料7.5 μL，DNA模板2 μL。PCR反应参数：94℃预变性10 min，94℃变性30 s，55℃退火60 s，72℃延伸30 s，共40循环，72℃终末延伸5 min。HRM反应参数：94℃变性1 min，40℃复性3 min，HRM 70～90℃，以0.05℃/s的斜率采集溶解曲线，在Rotor-Gene荧光定量PCR仪器基因扫描软件模块上进行分析。

1.2.5 HRM的基因分型：利用Tm温度的差异，直接区分样本对应的基因型纯合子和杂合子；但不足以区分不同纯合子之间Tm的差异［9］；采用参入法［10］进行区分不同纯合子分型，即在纯合子基因中掺入已知纯合子基因型，若与已知纯合子基因型相同表现为纯合子型曲线，相反表现为杂合子曲线，以达到区分不同纯合子基因型。

1.3 统计学处理

应用Haploview4.0软件进行Hardy-Weinberg遗传平衡检验，采用SPSS 19.0统计学软件进行分析。组间基因型及等位基因频率的分布差异采用χ2检验；多态性位点与2型糖尿病易感性的分析采用比值比（odds ratio，OR）及其95%可信区间（CI）表示。所有统计学分析均采用双尾概率检测，P＜0.05为具有统计学差异。

2 结果

2.1 SLC30A8基因型rs13266634 SNP的HRM基因分型结果

T2DM组模板DNA经PCR-HRM基因分型后得到3种基因型（杂合子型CT、纯合子型CC、纯合子型TT），见图1～4。

图1 SLC30A8-rs13266634-T2DM-HRMFig.1 SLC30A8 rs13266634-T2DM-HRM

图2 SLC30A8-rs13266634-T2DM-杂合MeltFig.2 SLC30A8 rs13266634-T2DM-heterozygotic Melt

图3 SLC30A8-rs13266634-T2DM-纯合MeltFig.3 SLC30A8rs13266634-T2DM-homozygotic Melt

图4 SLC30A8-rs13266634-T2DM-纯合造杂合HRMFig.4 SLC30A8 rs13266634-T2DM-forged heterozygotic Melt

2.2 Hardy-Weinberg平衡检验

采用Hardy-Weinberg平衡法检验SLC30A8基因rs13266634 C/T多态性位点均无统计学差异（P＞0.05），符合Hardy-Weinberg遗传平衡定律，证明本研究人群已达到遗传平衡，具有群体代表性。见表1。

2.3 rs13266634 C/T多态性位点基因型和等位基因型频率分布比较

如表2所示，CC基因型频率T2DM组高于NC组，且各基因型分布频率在2组间存在统计学差异（χ2=8.838，P=0.012）。两组C等位基因频率比较，T2DM组高于NC组，并且各等位基因型分布频率2组间存在统计学差异（χ2=6.566，P=0.010）。

表1 SLC30A8基因rs13266634 C/T多态性位点Hardy-Weinberg平衡检验Tab.1 Hardy-Weinberg equilibrium test of the rs13266634 C/T locus in SLC30A8gene

表2 SLC30A8基因rs13266634 C/T多态性位点基因型和等位基因型频率分布比较［n（%）］Tab.2 Genotype and allele frequencies of the rs13266634 C/T locus in SLC30A8gene［n（%）］

2.4 SLC30A8 SNP位点基因型和等位基因与2型糖尿病发病风险的预测

SLC30A8基因的rs13266634 C/T多态性遗传位点的CC基因型与2型糖尿病的联系强度OR值为1.452（95%CI：1.150～1.833，P＜0.05），意味着增加了2型糖尿病1.452倍患病风险。并且等位基因C与2型糖尿病的联系强度OR值为1.550（95%CI：1.108～2.169，P＜0.05），即增加了2型糖尿病1.550倍患病风险。

3 讨论

本研究在锦州地区的人群中初步验证了文献报道的SLC30A8的rs13266634 C/T的单核苷酸多态性，并且证实了rs13266634与T2DM易患性相关。本研究结果显示：不同于印度地区人群［7］，锦州地区T2DM组的rs13266634 C/T的CC基因型频率和C等位基因频率均高于NC组，这一结果与中国汉族人群相似［3］，说明存在地域和种族的差异。与此同时，等位基因C在两组之间的分布存在统计学差异（P＜0.05），等位基因C增加了2型糖尿病1.550倍患病风险。

研究显示，人类ZnT-8 DNA编码序列被发现在AC027419重叠区，SLC30A8作为锌转运体家族的一员，可定位在人8q24.11染色体上。包含8个外显子，全长37 kb，编码368个氨基酸蛋白。特异性的在胰岛β细胞高表达，位于胰岛素分泌颗粒膜中，能够促进锌离子在胰岛素分泌囊泡中聚集［11］，是参与胰岛素储存、合成、分泌的重要成分。定位于SLC30A8基因第8外显子的rs13266634多态性属于非同义突变，是由单个核苷酸改变引起的，即Arg325变异成Trp325（R325W）［7］。这一结果可能发生锌离子与胰岛素分子结合不稳，影响胰岛素储存、合成和分泌，导致胰岛素功能改变，增加T2DM的发病概率［12］。而本研究的结果也证实了SLC30A8基因的rs13266634 C/T多态性位点与2型糖尿病易感性相关，统计分析显示SLC30A8基因的rs13266634 C/T多态性遗传位点的CC基因型与2型糖尿病的联系强度OR值为1.452（95%CI：1.150～1.833，P＜0.05）；并且等位基因C与2型糖尿病的联系强度OR值为1.550（95%CI：1.108～2.169，P＜0.05），可以推测SLC30A8基因的rs13266634 C/T多态性遗传位点的CC基因型和等位基因C能够增加2型糖尿病的患病风险。

由于本研究人群量和人群覆盖地区有限，所得结果验证了SLC30A8基因的rs13266634 C/T多态性位点在锦州地区人群中的存在；并且与2型糖尿病易感性相关。CC基因型及等位基因C是2型糖尿病的风险因素，但仍需扩大研究样本进行进一步的验证。尽管SLC30A8是目前2型糖尿病的GWAS研究中易感基因之一，但是其导致2型糖尿病发病的病理生理机制不明，进一步研究其机制对糖尿病的预防及治疗具有重要的临床意义。

［1］Almgren P，Lehtovirta M，Isomaa B，et al.Heritability and familiality of type 2 diabetes and related quantitative traits in the Botnia Study［J］.Diabetologia，2011，54（11）：2811-2819.

［2］Sladek R，Rocheleau G，Rung J，et al.A genome-wide association study identifies novel risk loci for type 2 diabetes［J］.Nature，2007，445（7130）：881-885.

［3］Chang YC，Liu PH，Yu YH，et al.Validation of type 2 diabetes risk variants identified by genome-wide association studies in Han Chinese population：a replication study and meta-analysis［J］.PLoS One，2014，9（4）：1-8.

［4］Parra EJ，Below JE，Krithika S，et al.Genome-wide association study of type 2 diabetes in a sample from Mexico City and a metaanalysis of a Mexican-American sample from Starr County，Texas［J］.Diabetologia，2011，54（8）：2038-2046.

［5］Voight BF，Scott LJ，Steinthorsdottir V，et al.Twelve type 2 diabetes susceptibility loci identified through large-scale association analysis［J］.Nat Genet，2010，42（7）：579-589.

［6］Gamboa-Melendez MA，Huerta-Chagoya A，Moreno-Macias H，et al. Contribution of common genetic variation to the risk of type 2 diabetes in the Mexican Mestizo population［J］.Diabetes，2012，61（12）：3314-3321.

［7］Kommoju UJ，Maruda J，Kadarkarai S，et al.No detectable association of IGF2BP2 and SLC30A8 genes with type 2 diabetes in the population of Hyderabad，India［J］.Meta Gene，2013，1：15-23.

［8］Erali M，Wittwer CT.High resolution melting analysis for gene scanning［J］.Methods，2010，50（4）：250-261.

［9］Wittwer CT，Reed GH，Gundry CN，et al.High-resolution genotyping by amplicon melting analysis using LCGreen［J］.Clin Chem，2003，49（6 Pt 1）：853-860.

［10］Liew M，Seipp M，Durtschi J，et al.Closed-tube SNP genotyping without labeled probes/a comparison between unlabeled probe and amplicon melting［J］.Am J Clin Pathol，2007，127（3）：341-348.

［11］Chimienti F，Devergnas S，Favier A，et al.Identification and cloning of a beta-cell-specific zinc transporter，ZnT-8，localized into insulin secretory granules［J］.Diabetes，2004，53（9）：2330-2337.

［12］Ng MC，Park KS，Oh B，et al.Implication of genetic variants near TCF7L2，SLC30A8，HHEX，CDKAL1，CDKN2A/B，IGF2BP2，and FTO in type 2 diabetes and obesity in 6，719 Asians［J］.Diabetes，2008，57（8）：2226-2233.

（编辑武玉欣）

Research on Correlation between rs13266634 C/TSNP of SLC30A8Gene and Susceptibility to
Type 2 Diabetes Mellitus

LIUYang1，2，WANG Zhan-you2，3，CHI Zhi-hong2，WANG Tao3

（1.Center of Medical Laboratory，The Third Hospital Affiliated to Liaoning Medical College，Jinzhou 121000，China；2.Department of Pathophysiology，China Medical University，Shenyang 110001，China；3.The Institute of Neurosciences，College of Life and Health Sciences，Northeastern University，Shenyang 110015，China）

Objective To investigate the correlation between the rs13266634 C/T SNP of SLC30A8and T2DM in Jinzhou.MethodsBased on case-control study，PCR-HRM was used to identify the genotypes of rs13266634 of SLC30A8gene in 136 cases of T2DM patients and 145 cases of healthy control in Jinzhou.ResultsThe CC genotypic frequency and C allele frequency in T2DM（38.23%and 61.76%）were higher than those of healthy control（22.07%and 51.03%）.Furthermore，there was significant difference in case-control study from the population in Jinzhou（P＜0.05）.The odds ratio of allele C for T2DM was 1.550（95%CI：1.108-2.169，P＜0.05）.ConclusionThe single nucleotide polymorphism of the rs13266634 locusin SLC30A8 gene was correlated with T2DM susceptibility in Jinzhou，and the allele C was a risk allele.

SLC30A8gene；single nucleotide polymorphism；high-resolution melting curve；type 2 diabetes mellitus

R587.1

A

0258-4646（2015）06-0494-04

国家自然科学基金（81170775）

刘阳（1975-），女，主管技师，硕士研究生. E-mail：jykly43@aliyun.com

2015-01-12

网络出版时间：