聂文波　汪明星　张振华　孙付杰

密度梯度离心法结合贴壁筛选法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞的生物学特性

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【摘要】目的 通过密度梯度离心法结合全骨髓贴壁法体外分离、培养、纯化骨髓间充质干细胞。方法 采用密度梯度离心法结合全骨髓贴壁法，对大鼠骨髓间充质干细胞进行体外分离后传代培养，倒置相差显微镜下观察形态变化，流式细胞仪检测细胞标记物表达。结果 P3代大鼠BMSCs细胞培养5天，CD29、CD90、CD34阳性率分别为94.27%、91.16%、1.72%。结论 密度梯度离心法结合全骨髓贴壁法成功分离培养了高纯度、高活性、生物学形态和特征稳定的骨髓间充质干细胞。

【关键词】骨髓间充质干细胞；贴壁法筛选法；细胞培养

作者单位：1 274300 山东省菏泽市单县中心医院脊柱外科；2 221006徐州医学院第二附属医院

间充质干细胞（marrow mesenchymal stem cells, MSCs）来源于早期发育的胚层，在人体各器官组织内分布相当广泛，被称为骨髓间充质干细胞[1]。BMSCs作为一种多功能肝细胞，能在合适的前提下分化为：骨细胞、神经细胞、脂肪细胞等等。而BMSCs，来源丰富，同时还具备取材方便的优点，因此非常适合进行体外培养，简单有效、增值速度相当快，同时还可避免概念上的歧义，因此BMSCs广泛应用于临床医学、检验学等多个领域，被学术界称为织工程种子的最佳组细胞来源。本次研究应用密度梯度离心法结合贴壁筛选法从大鼠骨髓中分离培养BMSCs，为进一步试验提供细胞基础。

1　材料与方法

1.1主要试验材料及设备

SD大鼠，4周龄，体重120～200 g，由徐州医学院实验动物中心提供；胎牛血清（FBS），塞默飞世尔生物公司；DMEM/F-12培养基，塞默飞世尔生物公司；胰蛋白酶，Beyotime公司生产；Percoll分离液，上海Rego公司；恒温箱，上海跃进医疗器械；5%CO2培养箱， Thermo电器公司；离心机，eppendorf公司；倒置相差显微镜，COIC公司；流式细胞仪，美国BD公司。

1.2方法

BMSCs的分离、培养及传代、扩增：大白鼠处死后体积分数控制在75%，在乙醇中浸泡5 min，采用无菌操作分离大鼠股骨、胫骨，清除附着的肌肉组织，暴露骨髓腔并用PBS反复冲洗，收集细胞冲洗液并过筛网制成单细胞悬液，离心收集骨髓细胞，对管内细胞用含有10%FBS的DMEM/F-12的培养基，进行悬浮离心操作，并计数。将细胞密度控制在2×106/ml，在25 cm2的培养瓶中进行接种。原代接种后，静置培养，24 h后首次全量换液，之后每3 d全量换液。待细胞生长至80%～90%融合时，进行胰酶消化与传代培养（按1：3的比例）[2]。

BMSCs的形态观察学：对原代、传代培养的BMSCs，在倒置相差显微镜下进行观察，主要内容包括细胞形态及生长情况，频率为1次/d。

流式细胞仪法鉴定BMSCs分子表面标志：收集处于对数生长期的P3代细胞，胰酶消化、多聚甲醛固定后分为三管，分别加入稀释的单克隆抗体（FITC标记CD29、CD90；单克隆抗体、PE标记CD34），充分混合后在室温条件下避光孵育20min。用流式细胞仪检测细胞表面分子标志，使用仪器自带软件记录、分析并导出结果[3]。

2　结果

2.1BMSCSs的形态学观察

接种24 h之后，后贴壁细胞与细胞贴壁增多现象明显，倒置相差显微镜下细胞形态主要包括圆形和椭圆形。贴壁细胞形状呈长梭形，未贴壁细胞形态圆且亮。2 d之后，贴壁细胞明显增多、并有二角形、多边形或者不规则形状细胞出现，贴壁细胞呈团簇状生长。5 d之后，细胞形态发生变化，呈大条的纤维状，大量细胞呈外放射状向外生长，细胞排列工整。原代培养7～9 d左右细胞融合率达到80%～90%，铺满瓶底，有传代能力。刚传代的细胞呈圆形，传代培养的细胞生长速度较快，接种2～4 h后在倒置相差显微镜下即可发现有贴壁，细胞伸展生长，呈放射状或不规则状生长，细胞形态多样，大部分为梭形；另一种形态为宽阔扁平状，形态各异，细胞核为圆形或椭圆形，长满后出现抑制且停止增殖。细胞培养至第三代时，倒置相差显微镜下观察5 d即可达到80%～90%融合。

2.2SD大鼠BMSCs表面抗原鉴定

P3代大鼠BMSCs细胞培养5天，经流式细胞仪检测，CD29、CD90、CD34阳性率分别为94.27%、91.16%、1.72%。

3　讨论

BMSCs的抗原表型具有多样化特征，同时具备间充质细胞、内皮细胞与肌细胞的特征，无特异性标志。BMSCs与造血细胞共存于骨髓中，据文献中数据解释：BMSCs表面抗原主要有：CD90、CD105、CD29、SH-3、SH-4 CD44、CD71、CD106、SB-10等阳性表面抗原；另外，造血细胞不表达表面抗原的有：CD45（白细胞标志抗原），CD11（淋巴细胞表面抗原）与CD34（造血前体细胞抗源）。

综上所述，用密度梯度离心结合贴壁法分离培养的BMSCs，纯度较高，并可以快速扩增并分化，细胞表型鉴定CD29、CD90阳性、CD34阴性，是细胞移植的理想种子细胞，有良好的应用前景。

参考文献

[1] 吴国平，滕利，杨锴，等. 密度梯度离心并贴壁法分离成人骨髓间充质干细胞的成骨特性[J]. 中国组织工程研究与临床康复，2007，11(7)：1209-1212，1401.

[2] 曾瑞霞，单伟，房艳，等. 密度梯度离心法结合贴壁法体外分离培养大鼠骨髓间充质干细胞[J]. 解剖科学进展，2012，18(5)：438-441.

[3] 付文玉，路艳蒙，朴英杰. 人骨髓间充质干细胞的分化与端粒酶活性[J]. 第一军医大学学报，2001，21(11)：801-804.

Biological Characteristics of Rat Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells Isolated by Density Gradient Centrifugation Combined With Adherence Screening Method

NIE Wenbo1WANG Mingxing2ZHANG Zhenhua1SUN Fujie1, 1 Spine Surgery, Center Hospital of Shandong Heze Shanxian County, Heze 274300, China, 2 the Second Hospital Affiliated to Xuzhou Medical College, Xuzhou 221006, China

[Abstract] Objective To evaluate the biological characteristics, phenotype of bone marrow mesenchymaI stem cells that are isolated. Methods Bone marrow mesenchymal stem cells were isolated, purified and cultured by the whole bone marrow adherence method. Morphological observation and flow cytometry determination of celI surface markers were performed., Results The positive rates of BMSCs, CD34 and CD29 were 5, 91.16% and 94.27% in P3 cells cultured in CD90 generation. Conclusion The whole bone marrow adherence method is easy to operate, and can be used to harvest high-purification bone marrow mesenchymal stem cells with high cell viability and diferentiation ability.

[Key words]The whole bone marrow adherence method, Mesenchymal stern cells, Cultured

doi：10.3969/j.issn.1674-9308.2015.21.051

【文章编号】1674-9308（2015）21-0069-02

【文献标识码】B

【中图分类号】R361