黄瑞芹 李敏264000山东烟台毓璜顶医院

血清饥饿对大鼠血管平滑肌细胞黏附和铺展的影响

黄瑞芹 李敏
264000山东烟台毓璜顶医院

目的：探讨血清饥饿对大鼠血管平滑肌细胞黏附和铺展的影响。方法：培养大鼠血管平滑肌细胞，分为对照组与实验组。对照组给予含10％血清的DMEM，实验组给予DMEM，比较两组细胞黏附数及铺展情况。结果：实验组平滑肌细胞黏附数目平均（127±11）个，对照组细胞黏附数目（194±9）个。对照组细胞铺展较开，并有伪足伸出，实验组平滑肌细胞铺展效果较差，伪足伸出不明显。结论：血清饥饿在一定程度上能抑制大鼠血管平滑肌细胞的黏附和铺展。

血清饥饿；平滑肌细胞；细胞培养；黏附；铺展

动脉粥样硬化（AS）是心脑血管疾病的主要病理基础[1]。研究表明，在动脉粥样硬化病变早期血管细胞黏附分子（VCAM-1）主要促使单核细胞向内皮黏附，而T淋巴细胞、单核细胞与血管内皮细胞发生黏附表示动脉粥样硬化形成早期炎症的开始。因此，本实验主要研究了血清饥饿对血管平滑肌细胞黏附和铺展的影响。

资料与方法

实验器材：超净工作台；CO2培养箱；倒置相差显微镜；低温高速离心机；超声波清洗器；细胞计数板；三用恒温水箱等。

实验试剂：单克隆抗α-actin抗体，ABC复合物，胰蛋白酶；生物素化羊抗小鼠IgG；罗丹明标记山羊抗小鼠IgG；新鲜小牛血清、培养基DMEM、尼古丁等。

方法如下：血管平滑肌细胞（VSMC）的培养：组织块法培养原代VSMCs：①取8～10周龄雄性大鼠，在无菌条件下取胸主动脉，用PBS缓冲液洗去血污；②将动脉切成2.5～3.0 cm长的小段，在盛有培养液的培养皿中剥离外膜、中膜；③纵行剪开动脉，内膜朝上平摊于培养皿上，以棉签或圆钝的镊子轻轻刮去内皮细胞；④在培养液中洗净动脉中膜，平铺在另1个培养皿内，用刀片切成1mm3的组织块并接种到培养瓶中，按等距排列。加入含20％小牛血清的培养液，塞紧瓶口。为使组织块不与培养液接触，将贴有组织块的一侧朝上，置于37℃，5％CO2培养箱中培养。4～6 h后轻轻翻转培养瓶，使组织块浸入培养液中，继续静置培养。每3 d换液1次。细胞从组织块边缘长出时间约4～6 d，1～2周时出现致密的细胞层。

血清饥饿刺激：①取传代培养VSMC于6孔培养板中，A（实验组）：2 mL DMEM；F（对照组）：2 mL含10％血清的DMEM，放在37℃、5％二氧化碳培养箱中培养24 h，0.125％胰蛋白酶溶液消化2～3 s，把细胞从培养瓶壁上消化下来，用DMEM终止胰蛋白酶消化，把细胞吹打成细胞悬浮液。②然后用细胞计数板计算A和F培养板中的细胞密度。③计算后按每孔3×105个加入6孔培养板，补充DMEM至1 mL。④然后再置于37℃、5％二氧化碳培养箱培养30 min。⑤培养完后把上层培养液吸去，再用PBS轻轻的清洗1～2遍，把未黏附的细胞冲洗掉。⑥黏附的细胞用1 mL甲醛（3.7％）固定。⑦固定后放在倒置显微镜下观察，然后用相机拍照（6孔培养板平均每孔拍9个视野）。⑧数出黏附细胞的个数。

扫描电镜标本的制备：①将DMEM处理的VSMC和含10％血清的DMEM的VSMC悬浮细胞用0.1 moL/L PBS清洗2次，1 000 r/min离心10 min。②用少量0.1moL/L PBS重悬，将细胞悬液分别放在盖玻片上于6孔培养板中室温静止10 min。③用生理盐水轻轻洗涤3次，然后用2.5％戊二醛（pH 7.2～7.4）固定20 min。④用70％、80％、95％和100％酒精，分别处理10 min取出后放再空气中让酒精挥发掉（CO2临界干燥），真空镀膜。⑤扫描电镜下观察并拍照。

统计方法：两组间实验数据以（x±s）表示。两组数据的重复性用函数STDEV表示。

结果

血清饥饿抑制大鼠血管平滑肌细胞的黏附和铺展：对照组和血清饥饿组的大鼠血管平滑肌细胞分别以3×105个/mL种到6孔培养板内，37℃、5％CO2培养箱中培养30 min，PBS缓冲液清洗，洗去未黏附的细胞，3.7％甲醛固定20 min，每孔选9个视野拍照后计数。实验组平滑肌细胞黏附数目平均（127±11）个，对照组细胞黏附数目（194±9）个，实验组细胞黏附数目是对照组的0.656倍，即血清饥饿组细胞黏附数目要少于实验对照组细胞。

血清饥饿对平滑肌细胞黏附铺展的扫描电镜结果：分别从两组细胞中挑选铺展效果较好的细胞进行对比。结果显示，血清对照组细胞铺展较开，并有伪足伸出，而实验组平滑肌细胞铺展效果较差，伪足伸出不是很明显。

讨论

动脉粥样硬化时细胞间质（如胶原）沉积增加，血管壁均增厚，管腔变窄，血管壁顺应性下降，血管平滑肌细胞均参与这些血管结构和功能的变化。血管平滑肌细胞是血管壁的主要细胞成分之一，位于血管壁中膜，也是决定血管构型和血管活性的重要因素。血管构型和血管活性在许多与心血管系统有关的疾病中发生明显变化。VSMC受多种因素调节，是介入术后血管再狭窄和冠状动脉粥样硬化等心血管病变中的主要细胞成分之一，各种信号途径和细胞因子相互作用，协调细胞病理及生理状态下的表达和功能。血管内皮生长因子能促进内皮细胞的增殖，增加血管通透性，促进血管渗漏，参与血管形成的启动过程，是目前已发现的比较重要和特异的促血管内皮细胞生长的正调节因子。很多研究表明，血清饥饿可以改变各种类型细胞的功能，如诱导肾脏近曲小管上皮细胞再分化、使体外培养的绵羊胚盘细胞进入G0期等。

[1]芮耀诚.抗动脉粥样硬化药物研究进展[J].国外医学·药学分册，1995，22（5）：257-259.

Influence of serum starvation on the adhesion and spreading out of vascular smooth muscle cell in rat

Huang Ruiqin，Li Min
Yuhuangding Hospitals of Yantai in Shandong 264000

Objective：To explore the influence of serum starvation on the adhesion and spreading out of vascular smooth muscle cell in rat.Methods：Vascular smooth muscle cells in rat cultivated were divided into the control group and the experimental group.The control group were given DMEM containing 10％serum，and the experimental group were given DMEM，then the cell adhesion amount and spreading out of the two groups were compared.Results：The average number of smooth muscle cell adhesion was （127±11）and that of the control group was（194±9）.The cells of the control group spread out and had pseudopod extend，the smooth muscle cells of the experimental group had poorer spreading effect and the pseudopodia was not obvious.Conclusion：Serum starvation inhibited the vascular smooth muscle cell adhesion and spreading out in rat to a certain extent.

Serum starvation；Smooth muscle cells；Cell culture；Adhesion；Spreading out

10.3969/j.issn.1007-614x.2015.21.1